[發(fā)明專利]一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測試方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810227542.0
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN108410943A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙長虹;朱新術(shù);解麗芹;張曉沛;王永學(xué);張其清
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/077
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測試方法，其特征在于，所述MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測試方法包括：

將經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為病變骨組織的標(biāo)本置于含10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液的已消毒培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿四周事先鋪好冰塊，于無菌操作臺內(nèi)迅速移入內(nèi)含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的雙抗的PBS液中洗滌3次～5次；用組織剪剔除脂肪組織、壞死組織；用PBS液沖洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液浸泡；

使用眼科剪剪碎為0.5mm³大小的塊狀，使用0.15％胰酶消化分解切碎的樣本；通過無菌240目篩網(wǎng)過濾器過濾后將濾網(wǎng)表面的組織收集到一新100ml離心管內(nèi)，用離心機1500rpm×5分鐘分離細(xì)胞；清洗五次后1640培養(yǎng)液重懸而后加入10％～12％的胎牛血清6×10⁵細(xì)胞/毫升；最后MC3T3-E1細(xì)胞在5％～8％的CO₂ 37℃的環(huán)境下孵育培養(yǎng)；制成MC3T3-E1細(xì)胞懸液；

選擇MC3T3-E1細(xì)胞，按2×10⁶mL^-1濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長至細(xì)胞密度達(dá)80％時，加入不同濃度油酸作為誘導(dǎo)劑；以基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM添加體積比例為10％～12％的胎牛血清，分別添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四種濃度為成MC3T3-E1細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；每二天換液一次，以未加誘導(dǎo)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶作為對照，4周后油紅O染色檢測；

MC3T3-E1細(xì)胞分化到實驗所需的時間點后，將孔板從培養(yǎng)箱取出，小心吸去培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，不要損壞底層細(xì)胞；清洗后，每孔加入對應(yīng)體積的hoechst33258工作液，室溫20℃～25℃，避光孵育15min；棄染液，用PBS輕緩清洗兩次，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長/發(fā)射波長＝360nm/480nm,檢測熒光強度；棄去染液并用PBS清洗三次，每孔加入對應(yīng)量的PBS和尼羅紅工作液，室溫20℃～25℃，避光孵育10min；

將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長/發(fā)射波長＝500nm/600nm,檢測熒光強度；將孔板置于熒光顯微鏡，在同一視野下，用藍(lán)色和紅色光道對胞核進(jìn)行觀察并拍照。

2.如權(quán)利要求1所述的MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測試方法，其特征在于，制成MC3T3-E1細(xì)胞懸液后，還需進(jìn)行：取制成MC3T3-E1細(xì)胞懸液步驟中的濃度為0.1-1.0mmol/L的成骨細(xì)胞液，培養(yǎng)20-28小時后加入濃度為0.1-1.0mmol/L的過氧化氫溶液；

去除原有α-MEM培養(yǎng)液，用正常α-MEM培養(yǎng)液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8毒性/增殖檢測試劑，37℃避光孵育3小時；

在450nm波長處，測定各孔光吸收值即可。