[發(fā)明專利]一種蘋果MdPHR1基因及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-03-15
• 公開（公告）號: CN108148849B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小非;郝玉金;李睿
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N5/10;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/20;A01H6/74
• 代理公司: 煙臺上禾知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37234
• 代理人: 劉志毅

本發(fā)明涉及一種蘋果MdPHR1基因及其制備方法和應(yīng)用，所述MdPHR1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用強啟動子驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將MdPHR1基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入蘋果王林愈傷組織和擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因蘋果王林愈傷組織和擬南芥。本發(fā)明首次通過植物基因工程技術(shù)提高磷酸鹽吸收的生產(chǎn)性狀，獲得了一種從蘋果中分離克隆出的促進磷酸鹽吸收的基因的完整編碼區(qū)段的DNA片段，并驗證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用MdPHR1基因在蘋果王林愈傷組織和擬南芥中超量表達(dá)之后的轉(zhuǎn)基因材料，磷酸鹽的吸收明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一種促進磷酸鹽吸收的基因及其應(yīng)用，具體涉及一種蘋果促進磷酸鹽吸收的基因MdPHR1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

磷是植物生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)元素，其不僅參與植物體內(nèi)重要化合物(磷脂、ATP和核酸等)的形成，而且在植物生命活動過程(光合作用、呼吸作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)中發(fā)揮著重要作用。然而，多數(shù)土壤中磷元素分布不均，并且多以植物難以利用的有機磷形式存在，植物因此常常受低磷脅迫影響。在生產(chǎn)中，人們通過施用磷肥來改善土壤有效磷含量不足的狀況提高作物產(chǎn)量，但卻導(dǎo)致了一系列環(huán)境污染問題。因此，通過分子生物學(xué)手段發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因，提高作物磷吸收能力對減少化肥使用具有重要意義。

AtPHR1是MYB-CC家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，是擬南芥中磷饑餓反應(yīng)中一種主要的轉(zhuǎn)錄激活因子。AtPHR1主要通過結(jié)合基因啟動子P1BS順式元件(GNATATNC)，而誘導(dǎo)一些Pi饑餓相關(guān)基因的表達(dá)。phr1突變體中磷含量顯著低于野生型，并且在磷缺乏條件下產(chǎn)生了花青苷積累的表型。相反，AtPHR1過表達(dá)株系中磷含量顯著增加，并且提高了擬南芥一系列磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)。AtPHR1的同源基因在多個物種中已被發(fā)現(xiàn)，包括水稻、玉米和大豆等；并且均能夠影響植物磷吸收，調(diào)控植物的生長發(fā)育。

我國是世界上蘋果種植面積最大和總產(chǎn)量最高的國家，同時，蘋果產(chǎn)業(yè)也是我國產(chǎn)量最大的果樹產(chǎn)業(yè)，蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對于提高農(nóng)民收入、解決剩余勞動力以及帶動下游附加產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到了關(guān)鍵作用。但是，我國蘋果產(chǎn)業(yè)與蘋果生產(chǎn)先進國家相比，生產(chǎn)水平還存在著較大差距。例如，肥料利用率低，特別是磷肥通過揮發(fā)、淋溶和徑流等途徑損失數(shù)量巨大。同時，由于片面追求產(chǎn)量與效益，果園內(nèi)大量施用磷肥，因此導(dǎo)致了土壤肥力下降、果實品質(zhì)降低和環(huán)境污染嚴(yán)重等后果，這嚴(yán)重制約了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

因此，為了減少化肥的施用特別是磷肥的施用，促進磷素的吸收，研究和了解蘋果中磷酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因功能對蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種蘋果促進磷酸鹽吸收的MdPHR1基因及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種蘋果促進磷酸鹽吸收的基因，是從蘋果中分離克隆出的磷酸鹽吸收相關(guān)的基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，并命名為MdPHR1，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本發(fā)明進一步解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種蘋果MdPHR1基因的制備方法，包括以下步驟：

(1)提取皇家嘎啦蘋果組培葉片中的RNA及反轉(zhuǎn)錄；

(2)cDNA全長序列的獲得：根據(jù)NCBI查到的擬南芥中AtPHR1基因保守氨基酸序列并進行同源序列比對獲得蘋果中MdPHR1基因的核苷酸序列，設(shè)計引物MdPHR1-F,MdPHR1-R，然后以反轉(zhuǎn)錄合成的嘎啦基因組cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列；其中，

MdPHR1-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，

MdPHR1-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；