[發明專利]用于檢測福氏志賀氏菌的特異性引物和探針以及實時熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 201810205787.3
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108660228A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 吳玲;徐紅;車團結;陳游;高愷;李亞鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11;C12Q1/6851;C12R1/01
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

本發明提供用于檢測福氏志賀氏菌的特異性引物和探針，所述探針序列為：5’?AGACGCCATCTCTTCTCG?3’；所述特異性引物為下述序列或為下述序列的互補鏈序列：上游引物序列為5’?TATAGTTTAGCTTGCCTTT?3’；下游引物序列為5’?CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT?3’。本發明提供用于福氏志賀氏菌進行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取福氏志賀氏菌的基因組DNA，結合實時熒光定量PCR檢測技術，可達到準確定量待測標本中福氏志賀氏菌含量的目的，具有高靈敏度和高特異性。本發明所提供的引物和探針對判斷福氏志賀氏菌活性菌的含量以至于后續研究泌尿道感染具有重要意義。

技術領域

本發明屬于分子生物學和體外診斷試劑技術領域，具體涉及用于檢測福氏志賀氏菌的特異性引物和探針以及實時熒光定量PCR試劑盒。

背景技術

福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)是一類革蘭陰性短小桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，主要流行于發展中國家，通稱痢疾桿菌，福氏志賀氏菌能夠引起細菌性痢疾。細菌性痢疾是最常見的腸道傳染病，夏秋兩季患者最多。傳染源主要為病人和帶菌者，通過污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經口感染。人類對志賀氏菌易感，10～200個細菌可使10～50％志愿者致病。一般說來，福氏志賀氏菌所致菌痢的病情較重。傳統的診斷福氏志賀氏菌的方法主要是通過細菌生理生化特性進行分類，需要大量的時間進行生理生化反應的結果判定，不利于及時找到病原，診斷病因。PCR技術作為一種分子生物學工具，可以選擇性體外擴增DNA或RNA片段，操作簡單、特異性強、快速、敏感性高等特點。Taq Man探針法檢測特異性強，靈敏度高，方便優化反應條件，能夠用于福氏志賀氏菌的快速檢測。

發明內容

本發明的目的在于設計一組福氏志賀氏菌特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應用于福氏志賀氏菌檢測的快速、靈敏、特異性好的用熒光定量PCR檢測的方法。本發明采用基因克隆技術，將福氏志賀氏菌16s基因片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有16s基因片段的重組質粒，以此作為標準品。根據福氏志賀氏菌16s基因片段編碼基因序列設計并合成一組特異性引物和探針，優化PCR反應條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進行評估。

本發明的第一個目的是提供用于檢測福氏志賀氏菌的特異性引物和探針，所述探針序列為：5’-AGACGCCATCTCTTCTCG-3’；

所述特異性引物為下述序列或為下述序列的互補鏈序列：

上游引物序列為5’-TATAGTTTAGCTTGCCTTT-3’；

下游引物序列為5’-CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT-3’。

作為優選，探針中5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

作為優選，所述上游引物和所述下游引物為向5’端和/或3’端方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得到的序列。

本發明的第二個目的是提供一種用于檢測福氏志賀氏菌的實時熒光定量PCR試劑盒，所述實時熒光定量PCR試劑盒包括權利要求1-3任一項所述的特異性引物和探針。

作為優選，在20μl PCR反應體系中，所述上游引物的用量為0.2μl，所述下游引物的用量為0.2μl，所述探針的用量為0.2μl。

作為優選，所述實時熒光定量PCR試劑盒還包括系列濃度標準品和陽性對照；所述系列濃度標準品是將福氏志賀氏菌16S基因與載體連接，轉化至感受態細胞中誘導表達，提取重組質粒，將重組質粒定量后稀釋，得到系列濃度標準品。

作為優選，所述標準品的核苷酸序列為序列表中序列2。

本發明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針、實時熒光定量PCR試劑盒在如下任一中的應用，所述應用不以疾病的診斷和治療為目的：