[發(fā)明專(zhuān)利]一種改造CHO-lec2細(xì)胞提高抗體糖鏈中半乳糖含量的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810190466.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110241134A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜標(biāo);吳鵬;任培玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院;中國(guó)科學(xué)院大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/13;C12N15/54
• 代理公司: 上海光華專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改造CHO?lec2細(xì)胞提高抗體糖鏈中半乳糖含量的方法。本發(fā)明對(duì)抗體生產(chǎn)常用細(xì)胞株CHO?lec2進(jìn)行了研究，意外發(fā)現(xiàn)在此細(xì)胞株的遺傳背景下過(guò)表達(dá)GT，可以顯著提高CHO?lec2細(xì)胞所表達(dá)的抗體的糖鏈中半乳糖含量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改造CHO-lec2細(xì)胞提高抗體糖鏈中半乳糖含量的方法。

背景技術(shù)

抗體在疾病治療方面發(fā)揮著重要的作用，ADC(抗體藥物偶聯(lián))類(lèi)抗體藥由于其偶聯(lián)抗體和小分子細(xì)胞毒性藥物以高效的靶向殺傷性逐漸進(jìn)入研究的焦點(diǎn)。通過(guò)抗體糖基化偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)的ADC逐漸得到人們的廣泛關(guān)注。人類(lèi)免疫球蛋白根據(jù)重鏈性質(zhì)的不同分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD 5種，臨床上最為常用的為IgG。IgG重鏈Fc段的CH2區(qū)域內(nèi)有一個(gè)保守的N-糖基化位點(diǎn)Asn297。該位點(diǎn)的糖基化結(jié)構(gòu)為核心巖藻糖基化的復(fù)雜雙天線模型，在不同的糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，糖鏈上分別添加巖藻糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等，使抗體呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性。抗體糖基化的不均一性，是通過(guò)糖基偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)ADC的一大技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種改造CHO-lec2細(xì)胞提高抗體糖鏈中半乳糖含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種表達(dá)抗體的方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒：將GT基因插入第一表達(dá)載體中，構(gòu)建GT重組質(zhì)粒，將抗體重鏈編碼基因插入到第二表達(dá)載體中，構(gòu)建抗體重鏈重組質(zhì)粒，將抗體輕鏈編碼基因插入到第三表達(dá)載體中，構(gòu)建抗體輕鏈重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)所獲得的GT重組質(zhì)粒、抗體重鏈重組質(zhì)粒及抗體輕鏈重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CHO-lec2細(xì)胞中，進(jìn)行抗體表達(dá)，在表達(dá)產(chǎn)物中分離獲得抗體。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述第一表達(dá)載體選自pcDNA3.1(+)(Ampicillin)、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述GT基因插入到第一表達(dá)載體中的限制性酶切位點(diǎn)之間。例如，所述GT基因插入到第一表達(dá)載體中的HindIII酶和XhoI酶的限制性酶切位點(diǎn)之間。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述第二表達(dá)載體選自pLONZA、pcDNA、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述抗體重鏈編碼基因插入到第二表達(dá)載體中的限制性酶切位點(diǎn)之間。例如，所述抗體重鏈編碼基因插入到第二表達(dá)載體中的BamH I和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn)之間。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述第三表達(dá)載體選自pLONZA、pcDNA、pVAX、pCMV、pGL、pMZ等。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述抗體輕鏈編碼基因插入到第三表達(dá)載體中的限制性酶切位點(diǎn)之間。例如，所述抗體輕鏈編碼基因插入到第三表達(dá)載體中的BamH I和EcoRI的限制性酶切位點(diǎn)之間。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，具體為：GT基因通過(guò)酶切、連接的方法插入到第一表達(dá)載體，第一連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的GT重組質(zhì)粒。抗體重鏈編碼基因通過(guò)酶切、連接的方法插入到第二表達(dá)載體，第二連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的抗體重鏈重組質(zhì)粒。抗體輕鏈編碼基因通過(guò)酶切、連接的方法插入到第三表達(dá)載體，第三連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的抗體輕鏈重組質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，GT重組質(zhì)粒、抗體重鏈重組質(zhì)粒及抗體輕鏈重組質(zhì)粒之間的質(zhì)量比例范圍是(2-5)：(50)：(50)。