[發明專利]一種含有CBD的融合基因、細胞系、液態ECM與應用

有效

• 申請號: 201810186004.1
• 申請日: 2018-03-07
• 公開（公告）號: CN110241128B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 索廣力;張書忙;喬勇;肖同乾
• 申請（專利權）人: 上海大學;中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;A61K38/48;A61P25/28
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

本發明公開了一種含有CBD的融合基因、細胞系、液態ECM與應用。所述含有CBD的融合基因為CBD?IDE融合基因或CBD?NEP融合基因，所述CBD?IDE和CBD?NEP融合基因的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。含有前述CBD的融合基因的細胞系能夠穩定表達且分泌生長因子IDE和NEP并結合在細胞外基質上。所述液態ECM由前述細胞系合成并分泌到胞外。本發明通過基因技術構建了攜帶有CBD的融合基因，進而使其所表達的IDE和NEP蛋白結合到ECM的膠原I上，達到在ECM上富集的目的，實現對阿爾茲海默癥的治療。

技術領域

本發明涉及一種液態ECM的制備方法，具體涉及一種含有CBD(Collagen BindingDomain，膠原結合域的簡稱，一段可以和膠原I結合的肽段)的融合基因、質粒、細胞系、液態ECM及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease，以下簡稱為AD)是老年人中最常見且最嚴重的系統退行性疾病之一。AD的病理特征主要是細胞內淀粉樣前體蛋白錯誤剪切產生有毒性的淀粉樣蛋白amyloid bata 42(簡稱Aβ42)并分泌到胞外沉積形成淀粉樣蛋白斑塊以及tau蛋白過度磷酸化而最終導致神經元之間相互黏連，阻礙神經傳導，進而導致記憶喪失(Association A.Alzheimer's disease facts and figures.Alzheimers Dement.,2012,8(2):131-168.)。目前針對AD的發病機理所采用的治療策略主要有三種：①消減Aβ,降解沉淀；②抑制tau過度磷酸化，防止神經元黏連；③兩種治療策略同步進行。治療方法中可用于消減Aβ蛋白的酶主要有腦啡肽酶((Neprilysin，以下簡稱NEP)：一種可降解淀粉樣蛋白的中性硫醇金屬蛋白酶)和胰島素降解酶((Insulin Degrading Enzyme，以下簡稱IDE)：一種可降解淀粉樣蛋白的金屬酶)(Dorfman V.B.,Pasquini L.,Riudavets M.,etal.Differential cerebral deposition of IDE and NEP in sporadic and familialAlzheimer's disease.Neurobiol.Aging,2010,31(10):1743-1757.)。

細胞外基質(Extracellular Matrix,以下簡稱ECM)，由細胞合成并分泌到胞外，分布在細胞表面或細胞之間的大分子物質。ECM由三類成分組成：結構蛋白,如膠原等；專一蛋白，如纖維蛋白等；蛋白聚糖。ECM是細胞賴以生存的外部環境，為細胞生長提供物理支持和適宜場所，通過信號轉導調控細胞的生長、增殖和分化，并且可為組織的再生提供良好的微環境。近年來，ECM已廣泛應用于組織工程的再生修復，并展現出了其良好的應用前景。其中不乏有大量的有關ECM制備方法與應用的研究(崔秉顯，樸索拉，閔炳顯；細胞衍生細胞外基質膜的制備方法：CN 101563450A；Xu Y.,Xu G.Y.,Tang C.,et al.Preparation andcharacterization of bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellularmatrix scaffolds.J.Biomed.Mater.Res.B,2015,103(3):670-678.)。ECM材料的來源主要有兩大類：一種是有特定組織器官直接脫細胞制備而成；另一種則是由細胞衍生制備的ECM。大體流程為：首先體外培養細胞生產ECM，其次去細胞制備ECM，最后凍干保存ECM。

雖然細胞外基質的制備技術已經相當成熟了，但也存在一些不足和劣勢。主要問題為：(1)目前所制備的ECM絕大多數為固態ECM，主要用于為組織工程提供支架材料，很少將ECM制備成液態ECM，作為藥物或藥物載體直接用于治療疾病；(2)目前所制備的ECM主要通過外加生長因子來實現其特定功能；(3)作為分泌型的NEP和IDE很難在病理位置富集，無法發揮其生物學功能。