[發明專利]一種含有CBD的融合基因、細胞系、液態ECM與應用

有效

• 申請號: 201810186004.1
• 申請日: 2018-03-07
• 公開（公告）號: CN110241128B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 索廣力;張書忙;喬勇;肖同乾
• 申請（專利權）人: 上海大學;中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/867;A61K38/48;A61P25/28
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

1.一種含有CBD的融合基因，其特征在于，所述融合基因為CBD-IDE融合基因或CBD-NEP融合基因，其中，所述CBD-IDE融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述CBD-NEP融合基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.攜帶有權利要求1所述的含有CBD的融合基因的重組表達載體。

3.根據權利要求2所述的含有CBD的融合基因的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體包括重組質粒。

4.轉化或轉染有權利要求2所述重組表達載體的宿主菌。

5.含有權利要求1所述的CBD的融合基因或權利要求2所述的重組表達載體的細胞系，所述細胞系能夠穩定表達且能夠分泌生長因子IDE和NEP并結合在ECM上。

6.一種液態ECM，其特征在于它是由權利要求5所述的細胞系合成并分泌到胞外。

7.根據權利要求6所述的液態ECM，其特征在于它富集有所要表達的、帶有CBD的IDE蛋白和帶有CBD的NEP蛋白。

8.根據權利要求6或7所述的液態ECM，其特征在于：所述液態ECM中IDE蛋白和NEP蛋白的總含量為5～20ng/mg。

9.根據權利要求6所述的液態ECM，其特征在于：所述液態ECM主要包含膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維蛋白。

10.權利要求6-9中任一項所述的液態ECM在消減淀粉樣蛋白沉淀中的應用。

11.權利要求6-9中任一項所述的液態ECM在用于制備治療阿爾茲海默癥的藥物中的應用。

12.一種藥物組合物，其特征在于包括權利要求6-9中任一項所述的液態ECM。

13.權利要求6-9中任一項所述的液態ECM的制備方法，其特征在于包括：

(1)用引物通過聚合酶鏈式反應對APP、NEP基因和IDE基因的cDNA進行擴增，再根據引物所選用的酶切位點將擴增出來的基因和原始載體骨架同時進行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段與載體酶切片段在DNA連接酶的作用下進行酶連反應，酶連反應結束后，酶連產物轉化進入感受態細胞中并擴增質粒，之后進行PCR擴增，構建得到重組質粒或重組表達載體；

(2)通過病毒包裝體系將重組質粒或重組表達載體整合到細胞基因組中，構建含有IDE和NEP生長因子的細胞以及過表達APP的AD細胞模型，使其穩定表達APP基因、NEP基因和IDE基因，并產生Aβ蛋白、NEP蛋白和IDE蛋白，獲得穩轉細胞系；

(3)對穩定表達NEP蛋白和IDE蛋白的細胞系進行培養，以提取液進行提取，獲得液態ECM。

14.根據權利要求13所述的制備方法，其特征在于：所述引物的序列分別如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:12所示。

15.根據權利要求13所述的制備方法，其特征在于：所述載體骨架包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體或非病毒的載體。

16.根據權利要求13所述的制備方法，其特征在于：所述細胞選用間充質干細胞。