[發(fā)明專利]一種與甲胺磷特異性結(jié)合的核酸適配體Met-G02及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810178499.3
• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108251429A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓芹芹;靖樂;夏雪山;汪穎;宋玉竹;劉麗
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種利用SELEX技術(shù)篩選得到與甲胺磷特異性結(jié)合的核酸適配體Met?G02，所述的核酸適配體是單鏈DNA，由82個核苷酸組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二級結(jié)構(gòu)含有突出的環(huán)和莖，且存在G?四鏈體結(jié)構(gòu)，其中Met?G02吉布斯自由能DG=?15.21。基于酶聯(lián)寡核苷酸吸附測定法進(jìn)行核酸適配體特異性、親和力和靈敏度等一系列性質(zhì)評估，顯示Met?G02解離常數(shù)K_d=11.77±2.07 nM，且能特異性與甲胺磷結(jié)合，因此該核酸適配體具有高特異性、高親和力的特點(diǎn)，可快速、靈敏地用于甲胺磷的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種與甲胺磷特異性結(jié)合的核酸適配體Met-G02及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

核酸適配體是經(jīng)過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SyStematic evolution ofligandS by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的能與金屬離子、小分子、生物大分子，甚至整個細(xì)胞高專一性和親和性結(jié)合的SSDNA或RNA分子。核酸適配體不僅具備抗體分子的識別特性，凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域，幾乎都可以用核酸適配體來代替，而且還具備自己獨(dú)特的優(yōu)異性能，其具有靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。核酸適配體及其相關(guān)篩選技術(shù)(SELEX)，核酸適配體近年來在治療新藥、藥物運(yùn)輸、癌細(xì)胞檢測、生物成像、生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、毒品檢測、抗病毒等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

甲胺磷（Methamidophos），是一種有機(jī)磷化合物，通常用作農(nóng)藥，它是一種廣譜高效殺蟲劑，用于防治棉花紅蜘蛛、蚜、螨等，對抗藥性蟲害有良好防治效果，在中國大陸的商品名為多滅靈。但是噴灑過甲胺磷的農(nóng)作物在作為食品原材料的加工過程中，因為處理不當(dāng)可能會有殘留，而食用含有甲胺磷的食物，會給人體的健康帶來巨大的危害。2008年1月，有消費(fèi)者購買餃子食用之后，全家出現(xiàn)中毒癥狀，該餃子被化驗出含甲胺磷殘留。并且甲胺磷對環(huán)境可能存在危害，它可以通過多種途徑流進(jìn)水體中，給人們的日常飲用水帶來安全問題。甲胺磷會抑制膽堿酯酶活性，造成神經(jīng)生理功能紊亂。短期內(nèi)接觸(口服、吸入、皮膚、粘膜)大量引起急性中毒。表現(xiàn)有頭痛、頭昏、食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、流涎、瞳孔縮小、呼吸道分泌物增多、多汗、肌束震顫等。重者出現(xiàn)肺水腫、腦水腫、昏迷、呼吸麻痹。部分病例可有心、肝、腎損害。少數(shù)嚴(yán)重病例在意識恢復(fù)后數(shù)周或數(shù)月發(fā)生周圍神經(jīng)病，個別嚴(yán)重病例可發(fā)生遲發(fā)性猝死，血膽堿酯酶活性降低。由于毒性強(qiáng)，中國大陸從2008年起亦公告停止生產(chǎn)及使用。

目前，檢測甲胺磷的方法主要是氣相色譜法。該種檢測方法需要特定的儀器設(shè)備、專業(yè)操作人員和一定的操作技能，無法廣泛應(yīng)用。因此為保證廣大人民群眾的身體健康，建立一種準(zhǔn)確可靠、靈敏快速、廣泛適用的檢測食品或水體中甲胺磷的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種與甲胺磷特異性結(jié)合的核酸適配體Met-G02，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；該核酸適配體為單鏈DNA，由82個核苷酸組成，拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)為直鏈狀；預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，且存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-15.21。

本發(fā)明另一目的是將上述與甲胺磷特異性結(jié)合的核酸適配體Met-G02應(yīng)用在制備檢測食品中甲胺磷的試劑或在制備檢測食品中甲胺磷的試劑盒中。

本發(fā)明通過如下方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的：

1、甲胺磷特異性核酸適配體的篩選、克隆、分離和測序