[發明專利]檢測食品中產氣莢膜梭菌和gyrA基因的引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810176257.0
• 申請日: 2018-03-02
• 公開（公告）號: CN108315449A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 吳冰;蔡先全;李蓉;邱德義
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

本發明公開了一種檢測食品中產氣莢膜梭菌和gyrA基因的引物、試劑盒和方法，該引物的序列和探針序列分別為:上游引物recAF；下游引物recAR；探針recAP；上游引物gyrAF；下游引物gyrAR；探針gyrAP。本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種引物且組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準確，適用于雙重ddPCR檢測食品中產氣莢膜梭菌及gyrA的試劑盒；本發明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測食品中產氣莢膜梭菌及gyrA的方法，該方法操作簡便、快速，檢測結果準確。

技術領域

本發明涉及一種檢測食品中產氣莢膜梭菌和gyrA基因的引物，本發明還涉及一種包含上述引物用于檢測食品中產氣莢膜梭菌及gyrA基因的雙重微滴式數字PCR(ddPCR)檢測試劑盒，本發明還涉及一種采用上述試劑盒檢測食品中產氣莢膜梭菌及gyrA基因的方法。

背景技術

產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是一種屬于梭菌屬的革蘭氏陽性菌，具有莢膜，可產生芽孢，不具有運動性。C.perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，該菌的致病因子是其所產生的外毒素。目前，已發現C.perfringens產生的外毒素多17種，并以α型、β型、ε型和ι型4種毒素最為常見；C.perfringens還會產生其他多種毒素或者潛在的致毒因子，如腸毒素(CPE)。根據所產毒素的不同，C.perfringens可分為5種類型。在美國和一些發展中國家，由A型C.perfringens菌引起的食物中毒是最常見報道的食物中毒之一。由C.perfringens導致的食物中毒多與水、肉和禽肉制品相關。調查美國1998―2010年由C.perfringens引起食物中毒的結果顯示，肉類食品占食物總量的92％，其中牛肉制品占46％，禽肉制品占30％，豬肉制品占16％。據報道，生鮮牛肉、豬肉、火雞肉和雞肉及各種肉制品中C.perfringens檢出率均超過10％，部分日本雞肉中檢出率甚至高達84％。最常見C.perfringens引起食物中毒的錯誤操作發生于食物加工和準備的過程中，占所有因素的93％。比如，肉制品煮制后經過不適當冷卻工藝(44％)；將肉制品放置于不合適貯藏溫度下(22％)。

16s RNA基因具有高度保守和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩定性，序列分析的重現性極高，進化速度十分緩慢，被稱為細菌的“活化石”，以往檢測細菌數量較多使用都是16s RNA。但是，然而隨著研究的深入,16SrRNA基因也表現出了不容忽視的缺點:高保守性使其不能很好的區分親緣關系較近的物種；在基因組內的多拷貝性使確定其序列的準確性降低。因此在進行更精確地分類鑒定和以及計算細菌某個毒力基因拷貝數時就很難確定。為彌補16SrRNA基因的缺點,人們開始嘗試使用其他不同的看家基因(如recA基因等)進行放線菌的分子生物學分析。recA是原核生物同源重組的中心分子,為單拷貝基因，在DNA重組和DNA損傷應急修復(SOS)過程中是一個關鍵的基因,常用于做細菌分型。本發明將其作為產氣莢膜梭菌的看家基因作為其分子鑒定基因，同時開展雙重數字PCR檢測其他毒力基因，從而不僅有效確定菌腫，而且還可以對毒力基因含量進行一個評估。

DNA促旋酶又叫螺旋酶(由gyrA基因編碼)，為原核生物拓撲異構酶Ⅱ，在基DNA的復制過程中起了很重要的作用。在無ATP時，切斷處于超螺旋狀態的DNA分子，使超螺旋松弛；在有ATP時，利用ATP使松弛狀態的DNA進入負超螺旋結構。同時桿菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥機制主要包括編碼靶酶DNA促旋酶和拓撲異構酶的基因突變；細菌膜通透性的降低以及膜的主動外排泵激活。

由于產氣莢膜梭菌屬于厭氧菌，其培養要求較高,需要特殊的厭氧培養條件和設備,加上還需要采取特殊采樣方式、應用相應培養基、鑒定試劑等,一般的實驗室難以開展對該菌的研究,故長期以來國內對厭氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少認識。在政府和民眾重視食品安全的今天,對食品中厭氧菌的危險性應該進行評估。