[發明專利]一種新的基因組甲基化文庫的構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810162430.1
• 申請日: 2018-02-27
• 公開（公告）號: CN110195095A
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 戴珩;柴燕群;章揚;黃炳頂;史耀舟;張偉
• 申請（專利權）人: 上海鯨舟基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;徐迅

1.一種甲基化測序文庫的構建方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(a)提供一待測樣本，將樣本中的DNA打斷，從而得到片段化DNA；

(b)將所述片段化DNA的5′-磷酸基團去除，從而得到5′去磷酸化DNA；

(c)對所述5′去磷酸化DNA進行補平反應，從而得到5′去磷酸化的平末端DNA；

(d)將所述平末端DNA與具有莖環結構的第一銜接子進行連接反應，從而得到第一連接產物；

(e)利用5-methyl-dCTP，以第一連接產物的一條單鏈為模板進行擴增反應，從而得到第一擴增產物；和

(f)利用所述的第一擴增產物得到甲基化測序文庫；

其中，所述的第一擴增產物包含：

(i)具有從5′到3′的式A結構的第一擴增產物A，和

(ii)具有從5′到3′的式B結構的第一擴增產物B，

S_a-L-S_bm (A)

S_b-L-S_am (B)

式中，

各“-”獨立地為鍵；

S_a為所述第一連接產物的一條單鏈；

S_b為所述第一連接產物的一條單鏈，且S_b的序列與S_a的序列反向互補；

S_am以S_b為模板合成，S_am為S_b的互補鏈，且S_am中的堿基C均為甲基化堿基C；

S_bm以S_a為模板合成，S_bm為S_a的互補鏈，且S_bm中的堿基C均為甲基化堿基C；

L為第一銜接子。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一銜接子具有從5′到3′的式C結構：

L₁-L₀-L₂ (C)

式中，

各“-”獨立地為鍵；

L₁和L₂為核苷酸連接序列，且L₁和L₂互補；

L₀為長度為4-20bp的間隔序列。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的L₁中的堿基C均為未甲基化的堿基C，且L₂中的堿基C均為甲基化堿基C；

較佳地，所述的第一銜接子的5′端有磷酸化修飾，且3′端沒有磷酸化修飾；

更佳地，所述的第一銜接子的序列如SEQ ID NO.:1所示。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(f)還包括步驟：

(1)利用重亞硫酸鹽處理，將第一擴增產物中未甲基化的堿基C轉換為堿基U，從而得到第一轉換產物；和

(2)將第一轉換產物與第二銜接子進行連接反應，從而得到甲基化測序文庫，其中，所述的第二銜接子為Methyl-Seq DNA Library Kit(Swift30024)中提供的Adapter 1和Adapter 2。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(f)還包括步驟：

(I)將第一擴增產物與第三銜接子進行連接反應，從而得到第三連接產物，其中，所述的第三銜接子具有環形結構，且環形結構中帶有堿基U，較佳地所述的第三銜接子為NEBNext Methylated Adaptor，；

(II)利用重亞硫酸鹽處理，將第三連接產物中未甲基化的堿基C轉換為堿基U，從而得到第二轉換產物；和

(III)對第二轉換產物進行擴增反應，從而得到甲基化測序文庫。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段化DNA的長度為150～180bp。