[發明專利]人雙調蛋白克隆至人工改造的表達載體pGEX-4T-1及其原核可溶性表達的研究在審
| 申請號： | 201810144233.7 | 申請日： | 2018-02-12 |
| 公開（公告）號： | CN108220320A | 公開（公告）日： | 2018-06-29 |
| 發明（設計）人： | 黃娟;李學斌;萬惠丹 | 申請（專利權）人： | 武漢伊艾博科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/66;C12N15/12;C12N1/21;C07K19/00;C07K14/47;C07K1/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 430079 湖北省武漢市東湖開發區關*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 雙調蛋白 可溶性表達 表達載體 人工改造 重組蛋白 標簽 克隆 原核 谷胱甘肽轉移酶 構建重組質粒 原核表達系統 原核表達載體 分離純化 目標蛋白 生理功能 天然蛋白 天然結構 外源基因 重組質粒 包涵體 酶切 真核 去除 研究 切除 基因 優化 生產 | ||
1.人雙調蛋白克隆至人工改造的表達載體pGEX-4T-1，其特征在于，包括下述步驟，
（1）通過雙酶切、連接、轉化等方法成功構建融合表達載體pGEX-4T-1-SUMO；
（2）人工合成人雙調蛋白基因AREG，AREG和pGEX-4T-1-SUMO經BamHl和Xhol 雙酶切后連接，構建重組質粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG；
（3）然后用CaCl2法將重組質粒轉化到原核表達宿主Rosetta(DE3)中，構建工程菌。
2.如權利要求書1所述的人雙調蛋白克隆至人工改造的表達載體pGEX-4T-1過程，其特征在于，所述步驟（1）中，利用HeLa細胞cDNA文庫為模板，通過PCR擴增得到人SUMO基因，然后將pGEX-4T-1和SUMO基因經MscI、BamHl雙酶切，通過連接轉化構建pGEX-4T-1-SUMO。
3.如權利要求書1所述的人雙調蛋白克隆至人工改造的表達載體pGEX-4T-1過程，其特征在于，所述步驟（2）中，人工合成的人AREG蛋白大小約為25.8KD。
4.人雙調蛋白可溶性表達的研究，其特征在于，構建好的工程菌用IPTG誘導表達，并從誘導溫度和IPTG濃度兩個方面對目標蛋白可溶性表達進行優化。
5. 融合蛋白SUMO-AREG的純化及標簽蛋白SUMO的切除，其特征在于，用Ni-NTA親和層析純化SUMO-AREG，CoolCutter? SUMO蛋白酶切除SUMO標簽，進一步用Ni-NTA親和層析純化酶切產物。
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