[發(fā)明專利]用于香榧苗期性別鑒定的特異性分子標(biāo)記TGMI001

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810144040.1
• 申請(qǐng)日: 2018-02-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108165652B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧江杰;劉玉洋;葉生月;張敏;吳水木
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué);桐廬縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化辦公室;景寧嘉樹(shù)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司;桐廬翌鑫農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 黃前澤

本發(fā)明公開(kāi)了用于香榧苗期性別鑒定的特異性分子標(biāo)記TGMI001。本分子標(biāo)記TGMI001的上游引物TGMI001?F核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，下游引物TGMI001?R核苷酸序列如SEQ.ID No2所示；所述標(biāo)記在雄性個(gè)體中擴(kuò)增所得特異性條帶核苷酸序列如SEQ.ID No3所示。本特異性分子標(biāo)記TGMI001可用于香榧苗期雌雄性別的早期鑒定檢測(cè)，不但可以打擊香榧幼苗摻假行為，減少損失，而且有助于造林時(shí)開(kāi)展雌雄幼苗合理規(guī)劃，避免大量雄株在生產(chǎn)中造成浪費(fèi)；此外本特異性分子標(biāo)記可用于雌雄性別標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率，縮短育種周期，具有很大的應(yīng)用潛力和較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于經(jīng)濟(jì)林木分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種用于香榧苗期性別鑒定的特異性分子標(biāo)記TGMI001。

背景技術(shù)

香榧(Torreya grandis Fort.ex Lindl.cv.Merrillii Hu)是我國(guó)特有珍稀干果,是榧樹(shù)中唯一進(jìn)行人工規(guī)?；耘嗟膬?yōu)良變異類型，也是集材用、藥用、果用、油用和觀賞于一體的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，據(jù)記載已有1300多年的栽培歷史。香榧經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，全國(guó)對(duì)香榧苗木的需求量大，播種育苗是香榧育苗的主要手段之一。但作為多年生雌雄異株樹(shù)種，香榧生長(zhǎng)緩慢，童期長(zhǎng)，實(shí)生苗繁殖一般需要15～20年才能開(kāi)花結(jié)實(shí)，未開(kāi)花的幼樹(shù)難以鑒別雌雄。生產(chǎn)上結(jié)合香榧風(fēng)媒傳粉的特點(diǎn)，多采用嫁接的方法來(lái)提早結(jié)實(shí)和提高產(chǎn)量。但接穗來(lái)自成年雌株，一方面采集接穗會(huì)影響母株產(chǎn)量，另一方面接穗價(jià)格高、且常有摻假現(xiàn)象。因此，開(kāi)展香榧苗期的性別鑒定，首先可以防止和杜絕以雄株冒充雌株的現(xiàn)象，減少損失；其次，在香榧雌株優(yōu)樹(shù)實(shí)生苗繁育的過(guò)程中可以提高育種效率；第三，通過(guò)香榧生產(chǎn)林中合理的性別布植，可以使畝產(chǎn)最大化。截止本發(fā)明，雖然有從形態(tài)標(biāo)記、生理生化、細(xì)胞染色體和AFLP標(biāo)記等多方面關(guān)于香榧性別的早期鑒定的研究報(bào)道，但均未找到一種準(zhǔn)確高效的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是為了改善上述問(wèn)題，提供一種用于香榧苗期性別鑒定的特異性分子標(biāo)記TGMI001。

本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種鑒別香榧苗期性別的特異性分子標(biāo)記引物，其特征在于該引物核苷酸序列如下：

上游引物TGMI001-F：5’-GCCCAGGCATTCTGAAACA-3’，如SEQ.ID No1所示；

下游引物TGMI001-R：5’-CCCCGTCCCAAAAAACAAA-3’，如SEQ.ID No2所示。

此對(duì)特異性分子標(biāo)記引物是采用普通PCR技術(shù)，利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(Start condon targeted polymorphism，SCoT)標(biāo)記通用引物對(duì)香榧雌株和雄株樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，篩選雌雄單株特異性條帶進(jìn)行測(cè)序，然后對(duì)測(cè)序獲得的香榧雌雄差異條帶序列進(jìn)行比對(duì)，并以此設(shè)計(jì)特異性引物(TGMI001-F/R)。該引物對(duì)具有極高的專一性，用此對(duì)引物對(duì)香榧雌雄單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有雄株能獲得461bp的DNA條帶，而雌株沒(méi)有；其雄株擴(kuò)增得到的特異片段核苷酸序列如SEQ.ID No3所示。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述特異性分子標(biāo)記引物對(duì)不同香榧幼苗進(jìn)行雌雄快速鑒定的方法。

本發(fā)明采用上述特異性分子標(biāo)記引物(TGMI001-F/R)作為特異性擴(kuò)增引物，以待測(cè)香榧樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)一條461bp的DNA條帶，則待測(cè)樣本為雄性個(gè)體；若電泳結(jié)果未出現(xiàn)一條461bp的DNA條帶，則待測(cè)樣本為雌性個(gè)體。

上述方法中擴(kuò)增引物的選擇、基因組DNA的提取確定，以及電泳檢測(cè)，這些步驟均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明特異性性分子標(biāo)記引物和檢測(cè)方法僅適用于香榧雌雄個(gè)體的鑒別，即待測(cè)樣本是限定為香榧樣本的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用本發(fā)明方法可對(duì)香榧個(gè)體進(jìn)行雌性性別的快速鑒定，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，是其他現(xiàn)有鑒別方法不能實(shí)現(xiàn)的。