[發(fā)明專利]一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810134698.4
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108103011B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張景程;張涌;馬曉楠;張敏;王勇勝
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明提供一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，成熟培養(yǎng)液包括10％的胎牛血清和1％的ITS?G，并含有0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β?雌二醇、10ng/mL的EGF、2.2mg/mL的bFGF和50ng/mL的CXCL12。利用上述培養(yǎng)液進行牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，可以提高牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟質(zhì)量、體外受精胚胎發(fā)育率和體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育率和囊胚質(zhì)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及家畜胚胎工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，以及使用該培養(yǎng)液培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是體外受精、體細(xì)胞核移植、動物胚胎體外生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因克隆等胚胎工程技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量直接決定了在受精或核移植后胚胎的發(fā)育潛能。卵母細(xì)胞體外成熟不僅受到卵巢周期、動物品種、卵泡大小、激素、血清等多種因素影響，而且與卵母細(xì)胞體外成熟的程序和方法及培養(yǎng)液成分密切相關(guān)，雖然卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)取得較大的進步，但目前體外成熟卵母細(xì)胞在發(fā)育能力上明顯低于體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞。

趨化因子CXCL12又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)，是小分子的細(xì)胞因子，屬于趨化因子蛋白家族。目前體外成熟培養(yǎng)液往往添加多種細(xì)胞因子(FSH、LH、雌二醇、HCG)達到促進動物卵母細(xì)胞的體外成熟目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為提高牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟質(zhì)量，提供一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，該體外成熟培養(yǎng)液包括體積分?jǐn)?shù)5～20％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)0.5～2％的ITS-G(含5～20mg/L的胰島素和2.8～11.0mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白)、0.05～0.1IU/mL的HMG、0.5～1.5μg/mL的17β-雌二醇、5～10ng/mL的EGF、1.1～3.3mg/mL的bFGF和10～100ng/mL的CXCL12。

優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)液包括體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1％的ITS-G(含10mg/L的胰島素和5.5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白)、0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β-雌二醇、10ng/mL的EGF、2.2mg/mL的bFGF和50ng/mL的CXCL12。

優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)液由無Hepes的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液及添加至該基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的所述胎牛血清、ITS-G、HMG、17β-雌二醇、EGF、bFGF和CXCL12組成。

一種牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

將牛卵母細(xì)胞放入卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～22小時，即獲得成熟的卵母細(xì)胞(M2期)；所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液即上述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液。

優(yōu)選的，所述牛卵母細(xì)胞選自GV期卵母細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液在放入牛卵母細(xì)胞前預(yù)熱1～3小時。

優(yōu)選的，所述預(yù)熱和培養(yǎng)于38.5℃、5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行。

優(yōu)選的，每400～600μL的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中放入30～50枚牛卵母細(xì)胞卵丘復(fù)合體(COCs)。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明提出的牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，通過所添加的CXCL12、ITS(胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白)、EGF及bFGF等組分，可有效提高牛體外受精胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎的早期胚胎發(fā)育率和質(zhì)量，達到了有效提高牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟質(zhì)量的目的。本發(fā)明提出的成熟培養(yǎng)方法操作簡單，無需更換培養(yǎng)液，使得所培養(yǎng)獲得的體外成熟卵母細(xì)胞在發(fā)育能力上顯著增強。