[發(fā)明專利]多肽的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810133794.7
• 申請日: 2018-02-09
• 公開（公告）號: CN108341883B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 劉河;郭曉春;楊惠仁;麻建杰;郭二明;王興輝
• 申請（專利權）人: 北京愛泰浦生物醫(yī)藥科技有限責任公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/04;C07K1/06
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 蘇紅梅

本發(fā)明涉及一種制備多肽或其藥學上可接受的鹽的方法包括以下步驟：1)在固相載體上合成全保護的肽序列，得到肽樹脂；2)用裂解液裂解肽樹脂，得到粗肽；3)采用碘氧化法對粗肽直接進行二硫鍵環(huán)化反應。所述制備方法適用于大規(guī)模制備所述多肽，制備規(guī)模可達百克到千克級。

技術領域

本發(fā)明涉及多肽的制備方法，特別是一種抗腫瘤多肽ATAP-M8的大規(guī)模制備方法。

背景技術

ATAP-M8是從Bfl-1(氨基酸147-175)衍生的一個新型的雙親尾錨多肽，和在很多腫瘤細胞表面高表達的整合素受體(Integrin)高結合的iRGD結構序列融合，經結構修飾得到的融合多肽。它可有效的識別癌細胞與正常細胞，定向將多肽帶入到腫瘤細胞區(qū)域，特異性殺死腫瘤細胞而降低對正常細胞的損傷。ATAP-M8是一個全新的多肽類抗癌藥物，能特異性識別細胞線粒體膜，經特殊的雙親螺旋結構定位在線粒體膜上打孔，物理性破壞線粒體結構，誘導細胞凋亡。

ATAP-M8含有38個氨基酸殘基，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其C末端的氨基酸(Cys)羧基為酰胺化結構，N末端的氨基酸(Lys)氨基為乙酰化結構，第30和38位的半胱氨酸巰基間生成分子內二硫鍵。

多肽的化學合成分為液相和固相兩種方法，其中液相法適合小肽的合成，對于長肽，固相法是目前普遍采用的多肽合成方法。固相肽合成反應的原理是，將多肽序列C端的第一個氨基酸的羧基，通過縮合反應固定在不容性的載體(樹脂)上，然后脫除氨基保護基，再與過量的活化后的第二個氨基酸的羧基反應，形成肽鍵。重復脫保護，縮合，洗滌過程，將肽鏈按順序延長，最后獲得所需長度的多肽序列。固相合成完成后，通過三氟乙酸將肽鏈從樹脂上裂解下來，并同時脫除所有的側鏈保護基團，再經高效液相色譜純化，即得所需多肽。固相合成的優(yōu)點是合成中最費時費力的純化步驟，均以簡單的洗滌和過濾完成，大大減輕純化難度，具有方便快捷，操作簡便和易于實現自動化的優(yōu)勢。

ATAP-M8由于其較長的氨基酸序列，以及活性構象α-螺旋和分子內二硫鍵的存在，常規(guī)的固相合成方法不能實現對其大規(guī)模的合成。

發(fā)明內容

本發(fā)明涉及ATAP-M8的大規(guī)模制備方法。該方法可制備百克級和千克級批次的ATAP-M8純肽。應用該方法制備的ATAP-M8多肽，純度98.5％，可作為抗腫瘤藥物臨床研究的原料藥。

本發(fā)明涉及一種制備SEQ ID NO.1所示多肽或其藥學上可接受的鹽的方法，

其中：C末端的半胱氨酸(C)羧基為酰胺化結構，N末端的賴氨酸(K)氨基為乙酰化結構，在氨基酸序列位置30和38的兩個Cys(C)殘基之間形成分子內二硫鍵，

包括以下步驟：

1)在固相載體上合成全保護的肽序列，得到肽樹脂；

2)用裂解液裂解肽樹脂，得到粗肽；

3)采用碘氧化法對粗肽直接進行二硫鍵環(huán)化反應，在氨基酸序列位置30和38的兩個Cys(C)殘基之間形成形成分子內二硫鍵。

在一個實施方案中，本發(fā)明所述的制備方法，其中，在步驟3)中對所述粗肽進行以下操作：

使用乙腈和醋酸的混合溶劑溶解粗肽，得到粗肽溶液；

向粗肽溶液中加入水，得到稀釋液；

攪拌中向稀釋液中逐滴加入碘甲醇溶液。

優(yōu)選地，所述混合溶劑中，乙腈和醋酸的體積比為0.5～1.5:1，優(yōu)選為0.8～1.2:1，更有選為0.9～1.1:1，進一步優(yōu)選為1:1；