[發明專利]用于檢測胡麻DNA的特異性引物和探針及實時熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 201810129952.1
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108103232A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 劉宇琴;徐紅;車團結;沈頌東;陳游;石文;張鐳;李亞鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

本發明提供用于檢測胡麻DNA的特異性引物和探針，所述探針序列為：5’?ATGACAATTTTGGACCCGACCTGGT?3’；所述特異性引物為下述序列或為下述序列的互補鏈序列：上游引物序列為5’?CTCCCAATGTTTGCGTATCCTA?3’；下游引物序列為5’?ATATCGACCCGAGTCAACCAAA?3’。本發明還提供相應的實時熒光定量PCR試劑盒。本發明的特異性引物和探針以及相應試劑盒能夠用于實時熒光定量PCR檢測，且所建立的方法具有高敏感性和高特異性，能夠從花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄欖和胡麻等多種油料作物中特異性鑒別胡麻油。

技術領域

本發明涉及分子生物學和體外診斷試劑技術領域，尤其涉及一種用于胡麻DNA檢測的實時熒光PCR試劑盒，尤其涉及用于檢測胡麻DNA的特異性引物和探針。

背景技術

檢測食用油DNA質量的基因主要有葉綠體ATP、RBCL基因和物種特異性基因。設計的引物均源自葉綠體上rbcL基因序列。葉綠體是植物細胞重要的細胞器，葉綠體DNA被廣泛用于系統進化的研究。葉綠體基因具有高度的保守型，而其中rbcL基因正是由于其進化特點而被廣泛用于植物系統發生的研究。它的一些編碼區在進化過程中速率較慢，比較保守，而一些非編碼區在不同的物種間進化速度卻比較快，具有一定的種間差異性和種內保守性，因而適合進行物種鑒別。通過對rbcL基因上一段序列進行通用引物設計，可以對不同的物種同時進行擴增，且同時具有種間差異性，在不同的物種之間差異比較大，易于進行物種鑒別。胡麻油中含有多種不飽和脂肪酸，如油酸(OLE)、亞油酸(LIO)、以及亞麻酸(LIN)，此外還含有食用纖維、維生素(A、B、D、E)、卵磷脂、木酚素、礦物質等營養成分，經常食用可以預防高血脂癥和動脈粥樣硬化。FAD(脂肪酸去飽和酶)是RBCL基因上用于合成多不飽和脂肪酸路徑中的關鍵酶，調節多不飽和脂肪酸的不飽和程度，同時在冷馴化過程中產生關鍵的冷激蛋白，在調節細胞正常功能上有重要作用。而脂肪酸去飽和酶3a基因(FAD3a)在胡麻的葉片和果球中都能檢測到轉錄產物，是胡麻脂肪酸合成的主要基因。

實時熒光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)技術從常規PCR定性檢測邁上量化的臺階，它相對常規PCR技術先進、操作簡便、利用實時熒光定量PCR技術能夠實現實時監測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點，因此非常適合臨床檢測。

實時熒光定量PCR技術有很多分支，其定量方式也不同，主要分為熒光染料嵌入技術、熒光探針技術和自身淬滅熒光技術等。熒光染料嵌入技術是利用SYBR green I嵌入DNA雙鏈是熒光強度增加的特性，將熒光信號引入雙鏈DNA，該方法特異性較差，結果常受到引物二聚體的存在的干擾而導致假陽性等問題，因此不適合用于食品快檢。而熒光探針技術如Taqman技術、分子信標技術等因為其特異性比熒光染料嵌入技術和自身淬滅熒光技術要好，因此更適合食品檢驗使用。

目前市場上頻繁出現食用油摻假行為，而運用分子生物學技術對食用油進行摻假檢測，首要前提是從油脂中提取出適合PCR擴增的DNA。由于精煉食用油生產需經過高溫及高壓等處理，其中的DNA降解為大小不一的碎片，且含量極低，這給DNA提取造成了很大困難。因而亟需構建快速、簡便、準確和高效的常見食用油摻假分子生物學鑒別技術體系，為食用油質量監管和控制提供科學手段。

發明內容

本發明提供了用于檢測胡麻DNA的特異性引物和探針，還提供一種用于胡麻DNA檢測的實時熒光PCR試劑盒，具有快速、簡便、準確、高效等優點，具有高敏感性和高特異性。

本發明的第一個目的是提供用于檢測胡麻DNA的特異性引物和探針，所述探針序列為：5’-ATGACAATTTTGGACCCGACCTGGT-3’；

所述特異性引物為下述序列或為下述序列的互補鏈序列：

上游引物序列為5’-CTCCCAATGTTTGCGTATCCTA-3’；