[發明專利]一種雙重重金屬離子的可視化定量檢測新方法

在審

• 申請號: 201810129689.6
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN108342456A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;黃昆侖;杜再慧;田晶晶
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6825;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
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本發明提供了一種基于雙重超快速PCR的雙重比色傳感新方法，用于Hg²⁺和Ag⁺的可視化超靈敏雙重檢測。該新方法根據汞離子胸腺嘧啶錯配，銀離子胞嘧啶錯配，設計超快速聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的雙重擴增引物和模板，同時通過該引物可結合酶聯核酸自組裝顯色模塊，整合建立一種新興的基于錯配的汞離子和銀離子雙重靶標功能核酸檢測新方法和生物傳感器。本發明所建立的檢測方法和生物傳感器，比傳統方法更快捷、更靈敏，具備特異性強、靈敏度高、檢測結果可靠等優點，可以簡化分析檢測步驟，縮短分析時間，更重要的是使在線實時檢測成為可能，便于攜帶和野外作業，在重金屬快速檢測領域，具有非常好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種雙重金屬的檢測方法和生物傳感器。

背景技術

自然界中的汞主要以三種形態存在，包括：單質汞(Hg)，有機汞(烷基汞、苯基汞)以及無機汞(Hg⁺和Hg²⁺鹽及其配合物)，并且各種物質之間可以進行生物、化學轉換。它是唯一一種在室溫條件下以液體形式存在的金屬，物理形狀為銀白色，熔點-38.87℃，沸點356.6℃，密度13.59克/立方厘米，元素符號為Hg。銀有單質狀態，但一般都以化合態存在于銀礦石中。它呈現白色有光澤的形態，熔點961.78℃，沸點2212℃，密度10.49克/立方厘米，元素符號為Ag。

傳統的Hg²⁺和Ag⁺的檢測方法主要包括原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)、電感耦合等離子體質譜法、電化學分析方法、原子吸收分光光度法等，這些檢測方法靈敏度高、檢測范圍廣、適合多種樣品分析；但由于大型儀器的使用，需要較高的維護成本、專業人員操作等使得檢測成本增加；同時樣品預處理過程復雜且部分需要使用腐蝕性試劑；檢測周期長；由于上述缺點，使得傳統方法不適合缺乏精密儀器的現場分析等缺點，難以滿足實際分析的要求等。

發明內容

本發明建立的檢測方法和生物傳感器，克服了現有檢測技術的不足，實現了對重金屬進行準確、快速、簡單高效的檢測和分析，是一種廉價、快速、靈敏、特異性強的雙重重金屬檢測新方法。

本發明的一個目的是提供一種金屬的檢測方法，所述方法包括體外核酸擴增技術,所述體外核酸擴增技術的反應體系包括下游引物、模板和至少兩種上游引物；所述至少兩種上游引物的各自的核苷酸序列中至少有一個核苷酸的堿基是不同的；所述至少兩種上游引物的每種上游引物包括：互補序列A、連接臂、互補序列B、可特異性擴增所述模板的核苷酸序列和可與待測金屬結合的核苷酸；所述連接臂位于所述互補序列A和互補序列B之間，所述可特異性擴增所述模板的核苷酸序列和可與待測金屬結合的核苷酸位于所述上游引物的5’端或3’端；所述互補序列A和所述互補序列B的核苷酸序列互補和/或反向互補；所述連接臂包括可抑制聚合酶結合的結構和/或可抑制體外核酸擴增過程中新鏈延伸的結構；所述下游引物包括可特異性擴增所述模板的核苷酸序列。

所述模板至少包括互補序列G、互補序列H和序列I；其中，所述互補序列G、互補序列H分別與所述至少兩種上游引物中的可特異性擴增所述模板的核苷酸序列互補和/或反向互補；所述序列I的核苷酸序列與所述下游引物中的可特異性擴增所述模板的核苷酸序列相同。

所述互補包括現有技術或公知常識所定義的互補或反向互補，和/或根據現有技術或公知常識所定義的互補原則進行互補或反向互補。

所述聚合酶包括可用于體外核酸擴增的聚合酶。

所述可特異性擴增所述模板的核苷酸序列具體包括根據所述模板的特征序列所設計的引物序列；所述特征序列包括現有技術或公知常識所定義的特征序列；所述設計包括現有技術或公知常識所記載的設計方法。

所述A、B、G、H、I只用于區別不同的互補序列或序列，不用于排序。