[發(fā)明專(zhuān)利]用于基因編輯的組合物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810111563.6
• 申請(qǐng)日: 2018-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108265072A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金寧一
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/74
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/74;C12N15/90;C12R1/25
• 代理公司: 北京知呱呱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 呂學(xué)文;武媛

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于基因編輯的組合物及其應(yīng)用，所述組合物包括基于植物乳桿菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯載體，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。本發(fā)明通過(guò)對(duì)一株植物乳桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其存在內(nèi)源性II型CRISPR/Cas系統(tǒng)。經(jīng)分子克隆，獲得表達(dá)內(nèi)源性Cas9蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，在植物乳桿菌株中表達(dá)表現(xiàn)出蛋白質(zhì)毒性，其產(chǎn)生了核酸切割活性，該Cas9蛋白(LpCas9)可在植物乳桿菌中的基因編輯中進(jìn)行應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建含有表達(dá)Cas9蛋白的基因的載體，同時(shí)與誘導(dǎo)肽進(jìn)行配合，可獲得Cas9蛋白的表達(dá)，并且表現(xiàn)出基因編輯的活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于植物乳桿菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯載體。

背景技術(shù)

自2013年，CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)成為最有效的基因編輯工具，已經(jīng)在多種真核生物、原核生物成功應(yīng)用。尤其是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，最先應(yīng)用于基因編輯工作研究中。利用該系統(tǒng)能夠高效、快速獲得基因修飾產(chǎn)物，廣泛用于細(xì)胞基因的敲除、基因突變模式生物的建立和原核細(xì)胞的敲除與插入領(lǐng)域。盡管該系統(tǒng)能夠有效對(duì)真核生物進(jìn)行編輯，但仍無(wú)法對(duì)所有原核生物實(shí)行有效的編輯。

目前只有鏈球菌、大腸桿菌和羅氏乳桿菌成功運(yùn)用該系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除，只有在大腸桿菌開(kāi)發(fā)出有效的基因敲入手段。然而，隨著共生菌群、益生菌研究的深入，微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的新型治療制劑和工程菌株亟待開(kāi)發(fā)，也對(duì)基因編輯工作提出了更高的要求，推動(dòng)了原核生物基因編輯研究的發(fā)展。

目前，益生菌研究在我國(guó)蓬勃發(fā)展，應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，但相關(guān)菌株編輯研究仍開(kāi)展緩慢。亟待研發(fā)處一種基于益生菌II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于基因編輯的組合物及其應(yīng)用，用以解決現(xiàn)有沒(méi)有針對(duì)益生菌II型CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)益生菌基因進(jìn)行編輯的工具的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于基因編輯的組合物，所述組合物包括基于植物乳桿菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯載體，其包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述Cas9基因連接在pSIP411質(zhì)粒形成的。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述Cas9基因的前可操作性的連接有啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為PorfX啟動(dòng)子。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，還包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的誘導(dǎo)肽。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)肽的濃度為40-60ng/mL。

所述的用于基因編輯的組合物在乳桿菌基因組編輯中的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明還提供一種基因編輯方法，所述方法為通過(guò)所述基于植物乳桿菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯載體與誘導(dǎo)肽共同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述基于植物乳桿菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯載體包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Cas9基因。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)一株植物乳桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其存在內(nèi)源性II型CRISPR/Cas系統(tǒng)。經(jīng)分子克隆，獲得表達(dá)內(nèi)源性Cas9蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，在植物乳桿菌株中表達(dá)表現(xiàn)出蛋白質(zhì)毒性，其產(chǎn)生了核酸切割活性，該Cas9蛋白(LpCas9)可在植物乳桿菌中的基因編輯中進(jìn)行應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建含有表達(dá)Cas9蛋白的基因的載體，同時(shí)與誘導(dǎo)肽進(jìn)行配合，可獲得Cas9蛋白的表達(dá)，并且表現(xiàn)出基因編輯的活性。

附圖說(shuō)明