[發(fā)明專利]抗PD-1單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810108897.8
• 申請(qǐng)日: 2018-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN108314734B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱鄭;王旻;邢黎軍;徐祎鳳;王紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C12N15/13;A61K39/395;A61P35/00;A61P31/00;G01N33/68
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本發(fā)明涉及一種新的抗PD?1單克隆抗體以及該抗體的可變區(qū)序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重組人PD?1蛋白(rhEPD?1)作為免疫原，免疫BAL b/c小鼠取免疫小鼠脾臟細(xì)胞并將其與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0?Ag14融合，獲得了可表達(dá)抗PD?1抗體的雜交瘤細(xì)胞株，此細(xì)胞株能夠穩(wěn)定分泌單一的單克隆抗體。本發(fā)明同時(shí)克隆了抗PD?1單克隆抗體的H鏈、L鏈可變區(qū)核苷酸及氨基酸序列。本發(fā)明的抗PD?1單克隆抗體可與PD?1特異性結(jié)合，阻斷PD1與PD?L1的結(jié)合，恢復(fù)T細(xì)胞的功能。可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，用于癌癥及感染性疾病的治療。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種能特異性結(jié)合PD-1的單克隆抗體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及所述單克隆抗體的制備方法，其可變區(qū)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雜交瘤技術(shù)(hybridoma technique)，又稱單克隆抗體技術(shù)，1975年Koehler和Milstein證明，將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞進(jìn)行融合，可形成針對(duì)某一抗原的特異性強(qiáng)的單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)利用了骨髓瘤細(xì)胞能在體外連續(xù)傳代和淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體或因子的特性，將兩種細(xì)胞進(jìn)行融合，則成功融合的細(xì)胞可具有這兩種細(xì)胞的主要特性。

PD-1/PD-L1免疫療法是通過阻斷二者間的相互作用來提高免疫應(yīng)答，具有治療多種類型腫瘤及感染性疾病的潛力。程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)是CD28超家族成員，為一種重要的免疫抑制分子，主要表達(dá)在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞上。PD-1與其配體PD-Ls(programmed death-1 ligands，主要是PD-L1與PD-L2)結(jié)合能夠抑制T細(xì)胞的增殖、活化和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，使機(jī)體免受自身免疫系統(tǒng)的攻擊。但在機(jī)體的腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，與T細(xì)胞上的PD-1發(fā)生結(jié)合后，誘導(dǎo)T細(xì)胞的衰竭，抑制T細(xì)胞的功能，無法有效激活免疫系統(tǒng)，引起腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。而針對(duì)PD-1、PD-L1的單克隆抗體可以阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合，使T細(xì)胞恢復(fù)活力，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。目前，多株抗PD-1和PD-L1的抗體已上市，用于多種腫瘤的治療，如Nivolumab(抗PD-1抗體)、Keytruda(抗PD-L1抗體)等。

本發(fā)明以重組人PD-1胞外區(qū)(rhEPD-1)蛋白為抗原，通過雜交瘤技術(shù)篩選制備得到高親和力的抗PD-1特異性單克隆抗體，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其高效生物學(xué)活性。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的

本發(fā)明目的之一在于提供一種抗PD-1單克隆抗體制備方法；

本發(fā)明目的之二在于提供了一種抗PD-1單克隆抗體；

本發(fā)明目的之三在于提供抗PD-1單克隆抗體的可變區(qū)氨基酸序列及核酸序列。

技術(shù)方案

本發(fā)明以實(shí)驗(yàn)室前期制備得到的重組人PD-1蛋白作為免疫原，多次免疫Bal b/c小鼠，待其血清效價(jià)達(dá)到融合要求，取其脾細(xì)胞與sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過HAT選擇性培養(yǎng)基篩選得到能穩(wěn)定分泌抗PD-1抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)亞克隆化及擴(kuò)大培養(yǎng)后，在分子水平上進(jìn)行抗體重、輕鏈可變區(qū)基因的調(diào)取；單克隆抗體可通過將雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后經(jīng)Protein A/G親和層析柱純化獲得。

有益效果

本發(fā)明成功制備了抗PD-1單克隆抗體，該抗體特異性好，結(jié)合率高，能阻斷PD-1與PD-L1生物結(jié)合。在體外能有效恢復(fù)淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)分泌IFN-γ和IL-2，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示了該單克隆抗體對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，此抗PD-1單克隆抗體是腫瘤免疫治療的潛在藥物。

附圖說明：