[發(fā)明專利]一種微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法

在審

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• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108375599A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅雪君;閆凱莉;唐良德;吳建輝
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

1.一種微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.蟲體清洗：挑取活蟲樣本，常溫清洗；

S2.取樣：在解剖鏡下迅速切取蟲體頭部，獲得樣品；

S3.固定、漂洗：將S2的樣品立即完全浸入2.5%戊二醛固定液中，4℃ 固定24～48h，再用0.1M PBS緩沖液漂洗4～6次，每次10～20 min；

S4.再固定、漂洗：將S3樣品完全浸入1%鋨酸，4℃ 2～4h，再用0.1M PBS緩沖液漂洗5次，每次10～20 min；

S5.脫水、置換：依次用梯度濃度的酒精沖洗S4的樣品，各8～12min，再用100%丙酮沖洗8～12 min；

S6.滲透浸樣：將S5的樣品用丙酮與Epon812樹脂不同比例混合物依次滲透浸樣（3:1滲透3h，1:1滲透4h，1:3滲透12h），最后用純樹脂滲透2次，每次24h；

S7.聚合干燥：將S6的樣品轉(zhuǎn)入包埋板中，加入純樹脂包埋并整姿，置于烘箱中依次按以下溫度和時間梯度聚合（35℃ 12 h，45℃ 24 h，60℃ 48 h），完成樣品處理；

S8.定位、切片、撈片烤干：將定位好的樣品用超薄切片機(jī)和鉆石刀進(jìn)行超薄切片，紅外燈下烤干；

S9.染色、觀察：切片用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色法染色，將銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察，拍照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，所述活蟲為成蟲。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，S3所述固定在加有2.5%戊二醛固定液的離心管中進(jìn)行，每次用0.1M PBS緩沖液漂洗樣品前，先靜置離心管使樣品沉淀于管底，然后小心吸去盡可能多的上層液體，不要吸走樣品，再小心滴加新的0.1M PBS緩沖液沖洗管底的樣品，加至離心管管口后靜置10min，重復(fù)以上操作4～6次，完成漂洗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，S4所述再固定、漂洗為在新離心管內(nèi)加入鋨酸，用小型昆蟲針將樣品轉(zhuǎn)入含鋨酸的離心管中，使樣品完全浸入，再漂洗，漂洗操作方法同權(quán)利要求3。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，S5中用于脫水的酒精濃度依次為30%、50%、70%、80%、90%、100%，沖洗與置換操作同權(quán)利要求3的漂洗操作。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，S8切片厚度70nm，用75目方華支持膜銅網(wǎng)撈片。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，S9染色方法為：鋪一塊硅膠染色墊，滴一滴醋酸雙氧鈾溶液50%飽和溶液后，用尖頭鑷子小心將銅網(wǎng)置于液滴上，切片朝下浸于染液，染色30min，染色后在銅網(wǎng)上滴加雙蒸水沖洗數(shù)次，以相同方法用檸檬酸鉛溶液染色25min，染畢用雙蒸水洗凈切片，置濾紙上晾干。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任一項所述的微小型昆蟲復(fù)眼的透射電鏡樣品制片方法，其特征在于，所述微小型昆蟲為薊馬。