[發(fā)明專利]一種檢測堿性磷酸酶的液晶生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810107545.0
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108375616A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周川華;字琴江;王瑾;趙文穎;曹秋娥
• 申請（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;亢能

1.一種檢測堿性磷酸酶的液晶生物傳感器，其特征在于：包括液晶敏感膜、滴加在所述液晶敏感膜上的5CB液晶分子和DMOAP修飾的上玻片，所述液晶敏感膜為先經(jīng)過硅烷化修飾，再利用戊二醛將納米金修飾到玻片表面制備得到，利用沉積到液晶敏感膜表面的銀納米顆粒對5-CB液晶分子產(chǎn)生擾亂來實現(xiàn)對堿性磷酸酶的檢測。

2.一種液晶生物傳感器的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1）、制備谷胱甘肽為配體的納米金；

步驟（2）、玻片的潔凈；

步驟（3）、DMOAP修飾的上玻片和氨基修飾的下玻片的制備；

步驟（4）、液晶敏感膜的制備

將步驟（3）的下玻片浸入濃度為0.5-1%的戊二醛水溶液中，室溫反應(yīng)1-2h，用超純水清洗干凈，N₂吹干，得到醛基功能的玻片基底；

然后在所述醛基功能的玻片基底表面滴加200μL步驟（1）的納米金，室溫反應(yīng)1 h左右，用超純水洗去未反應(yīng)的納米金，N₂吹干，得到液晶敏感膜；

步驟（5）、液晶生物傳感器的制備

將待檢測的不同濃度的堿性磷酸酶加入檢測液中，迅速混合均勻后滴加到上述液晶敏感膜表面，進(jìn)行避光反應(yīng)，酶促金屬化反應(yīng)結(jié)束后用超純水沖洗，N₂吹干，備用；

在上述酶促金屬化反應(yīng)結(jié)束后的液晶敏感膜上滴加1~2 μL 5CB液晶分子，蓋上步驟（3）的DMOAP修飾的上玻片，即得到用于檢測堿性磷酸酶的液晶生物傳感器。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，納米金的濃度為1.41×10^-8 mol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，將玻片浸泡在Piranha溶液中，置于80℃的水浴鍋中靜置1~2h，反應(yīng)結(jié)束后用大量的超純水和無水乙醇沖洗，然后用N₂吹干，放置于干烘箱中110℃干燥2~4h，放置于干烘箱中干燥，得到潔凈的玻片。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，DMOAP修飾的上玻片的制備方法為：

將潔凈的玻片浸入含有0.5-1%的DMOAP水溶液中，室溫條件下靜置反應(yīng)20-30min，用無水乙醇清洗未反應(yīng)的DMOAP，再用大量的超純水沖洗干凈，N₂吹干，放置于烘箱中干燥，得到DMOAP修飾的上玻片基底；

氨基修飾的下玻片的制備方法為：

將潔凈的玻片浸入含有1%DMOAP和4-6%APS的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，在水浴鍋中80℃恒溫反應(yīng)1.5h，用乙醇洗凈未反應(yīng)的DMOAP和APS，再用大量超純水清洗干凈，N₂吹干，放置在烘箱中干燥，使玻片表面修飾上長鏈烷基和氨基官能團(tuán)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（5）中，檢測液為含有2-8mmol/L抗壞血酸2-磷酸酯和2-8mmol/L硝酸銀的0.1-0.2mol/L、pH為9.5-10的二乙醇胺-硝酸緩沖溶液；液晶敏感膜表面滴加1-2 μL5CB液晶分子。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）制備谷胱甘肽為配體的納米金具體如下：

向1mL 1%的氯金酸中加入0.10mL谷胱甘肽(GSH，0.24 mol/L)，室溫下攪拌2~5分鐘，然后向溶液中緩慢滴加1 mol/L NaOH至溶液的pH介于2.5~3.0，溶液中出現(xiàn)大量的淺黃色沉淀，然后利用離心機(jī)采用6000~8000 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，棄去上清液得到Au(Ⅰ)-GSH沉淀，然后將該沉淀用5mmol/L氫氧化鈉溶解，加入11 mL超純水，然后調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0左右，向反應(yīng)液中緩慢滴加入0.1 mg/mL 硼氫化鈉100 μL，直至溶液變成棕黃色，在磁力攪拌器上采用600 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，室溫下反應(yīng)4 h，采用截留分子量為30kD的超濾管純化，最后將得到的溶液分散在4 mL超純水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8.權(quán)利要求1-7之一的檢測堿性磷酸酶的液晶生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1），將不同濃度的堿性磷酸酶加入到檢測液中，迅速混合均勻后滴加到權(quán)利要求1-6之一的納米金修飾的液晶敏感膜表面，進(jìn)行避光反應(yīng)；所述的檢測液為含有抗壞血酸2-磷酸酯和硝酸銀的的二乙醇胺-硝酸緩沖溶液；

步驟（2），將步驟（1）的液晶敏感膜用超純水沖洗，N₂吹干，然后滴加1-2 μL5CB液晶分子，蓋上DMOAP修飾的上玻片，得到液晶生物傳感器；

步驟（3），然后將上述液晶生物傳感器放置在25℃~27℃的恒溫加熱臺上，利用偏光顯微鏡在正交偏光模式下進(jìn)行觀察、拍照，得到不同濃度堿性磷酸酶的光學(xué)響應(yīng)圖像，利用該光學(xué)圖像上白色光斑的數(shù)量以及顏色的變化對堿性磷酸酶進(jìn)行定性和半定量檢測。