[發明專利]一種能高效克隆和溫度誘導表達的質粒載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201810104595.3
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108359678A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 安迎鋒;高何瑞;高嵩;王虹玲;許淑敏;張藝峰;劉霞;劉一菲;張錚;澤哈基;李秀通;廉興隆
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 董存壁

1.一種大腸桿菌質粒載體，其特征在于：質粒為閉合環狀雙鏈DNA，含有兩個多克隆位點(MCSs)，所述多克隆位點為能進行粘性末端克隆的位點和平末端克隆的位點，和能構建T載體并進行TA克隆的位點。

2.按權利要求1所述的質粒載體，其特征在于：所述載體還包括C末端His-tag編碼序列、pMB1復制子和卡那霉素抗性基因。

3.按權利要求1所述的質粒載體，其特征在于：所述載體啟動子為溫度誘導型pL/pR雙啟動子，并含有Cits857調控原件。

4.按權利要求1所述的質粒載體，其特征在于：所述兩個克隆位點區含有NdeI、SpeI、SalI、BsaI、BamHI、SacI或PstI粘性末端克隆位點，也包括能進行平末端克隆的位點StuI；同時還包括能構建T載體并進行TA克隆的AhdI位點。

5.按權利要求4所述的質粒載體，其特征在于：所述在載體片段兩端各引入一個3’凸出單個“T”堿基，形成T載體。

6.按權利要求1-4所述的質粒載體，其特征在于：所述載體為SEQ ID No:1中所示的堿基序列。

7.一種權利要求1所述的質粒的構建方法，其特征在于：

1)以pET3a質粒為模板，用引物PHis-for1和PHis-rev1進行PCR擴增，擴增產物命名為片段1；PHis-for1和PHis-rev1的引物序列為：PHis-for1(5’-AAAAC TGCAG CACCA CCACCACCAC CACTA AGGCT GCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’)和PHis-rev1(5’-GTAGT TTATCACAGT TAAAT TGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’)；

2)以pET9a質粒為模板，用引物PET9-for1和PET9-rev1進行PCR擴增，擴增產物命名為片段2；PET9-for1和PET9-rev1的序列為：PET9-for1(5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATATCCCTG ACTGC GTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC-3’)和PET9-rev1(5’-CAAAG GCCAGCAAAA GGCCA GGAAC CGTAAAAAGG CCGCG TTGCT GGCGT TT-3’)；

3)將上述片段1和片段2混合，并以混合物為模板，以PHis-for1和PET9-rev1為引物進行重疊延伸PCR，擴增產物命名為片段1+2；

4)以pET3a質粒為模板，用引物PT7-for2和PT7-rev2進行PCR擴增，擴增產物命名為片段3；PT7-for2和PT7-rev2引物的序列為：PT7-for2(5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTGGTACC AGATC TCGAT CCCGC GAAAT TAATACGAC-3’)和PT7-rev2(5’-AAAAC TGCAG CATATGTATATCTCC TTCTT AAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GGG-3’)；

5)以上述片段1+2和片段3混合物為模板，PHis-for1和PT7-rev2為引物進行重疊延伸PCR擴增，擴增產物命名為片段1+2+3，并用PCR純化試劑盒純化；

6)將上述純化后的片段1+2+3用PstI單酶切，經1％瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收；

7)將步驟6)得到的片段用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物純化后轉化大腸桿菌JM109菌株，得到質粒載體pANY-orig；

8)以質粒pBV220為模板，用引物TIE-KpnI-For和TIE-NdeI-Rev進行PCR擴增，擴增產物命名為片段4；TIE-KpnI-For和TIE-NdeI-Rev的引物序列為：TIE-KpnI-For(5’-CGGGGTACCG CGCCG ACCAG AACAC CTTGC CGATC-3’)和TIE-NdeI-Rev(5’-CGCGC ATATG TTCCTCCTTA ATTTT TAACC AATGC TTCG-3’)；

9)將步驟8)獲得PCR產物(即片段4)和步驟7)獲得pANY-orig同時用KpnI和NdeI進行雙酶切，經1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產物；

10)然后將酶切產物用T4 DNA連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌JM109菌株，再經抗性篩選即得質粒載體pANY-TIE；

11)以質粒pHisKan5(Freuler et al.2008)為模板，用引物CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle進行PCR擴增，擴增產物命名為片段5；CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle引物的序列為：CcdB-For2-middle(5’-GCCTG TCGAC CCTGG GTCTG GAGAC CGGCT TACTAAAAGC CAGAT AACAG TATGC G-3’)和CcdB-Rev2-middle(5’-CCAGG CCTGA CCATA GGTCGACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATA AGGGA GCCTG AC-3’)；

12)以上述片段5為模板，用引物CcdB-For2和CcdB-Rev2進行PCR擴增，擴增產物命名為片段6；CcdB-For2和CcdB-Rev2引物的序列為：CcdB-For2(5’-CGCGC ATATG ACTAG TAGGCCTGTC GACCC TGGGT CTGGA GACCG GC-3’；Nde I underlined)和CcdB-Rev2(5’-CATCTGCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGAC CATAG GTCGA CGAGA GACCG ACTGG C-3’；PstIunderlined)；

13)將步驟12)獲得PCR產物(即片段6)和步驟10)獲得pANY-TIE同時用PstI和NdeI進行雙酶切，經1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產物；

14)將步驟13)得到的酶切后的片段于連接體系內在室溫下進行連接，而后轉化大腸桿菌DB3.1菌株，再經抗性篩選即得質粒載體pANY3。

8.按權利要求7所述的質粒載體的構建方法，其特征在于：所述連接體系為含175U T4DNA連接酶(TaKaRa Co.)，1×連接buffer，約30ng酶切產物。