[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于多重干細(xì)胞復(fù)合凍干粉及溶媒的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810102578.6
• 申請(qǐng)日: 2018-02-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108272643B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳金蕓;張炬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 伯仕利生物科技發(fā)展（鹽城）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775;A61K8/02;A61K8/99;A61Q19/00
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王鑫

1.一種用于多重干細(xì)胞復(fù)合凍干粉及溶媒的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

⑴、臍帶、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，收取健康的臍帶和胎盤(pán)；在GMP實(shí)驗(yàn)室生物安全柜將胎盤(pán)剪碎至1.5-2.5mm³大小的組織塊，將所述組織塊分別置于T175培養(yǎng)瓶所盛的DMEM-LG細(xì)胞培養(yǎng)液中，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

每隔2-3天換液，直至有大量干細(xì)胞爬出后，棄去組織塊；細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，記為第一代，用0.28％胰酶進(jìn)行消化傳代；第二代后改用無(wú)抗生素DMEM-LG培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；依次傳代培養(yǎng)；

⑵、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，獲取健康人的脂肪組織100mg；將所述脂肪組織放入超凈臺(tái)中，用PBS反復(fù)沖洗，直至無(wú)明顯血污；收集到離心管中，加入0.5％的胰酶和0.1％膠原酶各10ml，將離心管密封，放入37℃恒溫?fù)u床中，180r×min^-1，震蕩消化30min；消化后從所述恒溫?fù)u床上取出，在1000rpm的條件下離心10min，去上清，以去除懸浮脂肪；再用0.16mol/L的NH4Cl溶解紅細(xì)胞，PBS洗滌3次，200目過(guò)濾，分離單個(gè)核細(xì)胞；移入DMEM-LG培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；同步驟⑴中進(jìn)行消化傳代；

⑶、臍帶、胎盤(pán)和脂肪三種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子檢測(cè)

將步驟⑴和步驟⑵中的干細(xì)胞培養(yǎng)至第五代時(shí)，收集培養(yǎng)上清，用Elisa法檢測(cè)所述干細(xì)胞因子濃度，包括EGF、PDGF和VEGF；

⑷、臍帶、胎盤(pán)和脂肪三種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清調(diào)配及檢測(cè)

將步驟⑴和步驟⑵中獲取的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三種培養(yǎng)上清以1：1：1配比，檢測(cè)混合液與單獨(dú)上清對(duì)3T3細(xì)胞增殖的刺激作用；

將3T3細(xì)胞培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，胰酶消化，計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞鋪至八塊六孔板上，每?jī)蓧K板為一組，每塊板上設(shè)有四孔，每孔內(nèi)鋪1×103個(gè)細(xì)胞，分別添加步驟⑶及步驟⑷調(diào)配的上清；并培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，每板取1孔計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)；從曲線(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，三種干細(xì)胞培養(yǎng)上清分別刺激3T3的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，而復(fù)合上清刺激3T3的生長(zhǎng)在72h刺激后開(kāi)始有所差異；

⑸、種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的凍干粉制備

將步驟⑴和步驟⑵中獲取的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞三種培養(yǎng)上清加入10％BSA作為賦形劑，充分溶解后，0.45um過(guò)濾裝入凍干瓶中；將凍干瓶置于-80℃進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍24h后取出置于凍干機(jī)凍干；

⑹、凍干粉溶媒的配制

將1％透明質(zhì)酸、10％甘油、5％丁二醇，其余為雙蒸水，配制成凍干粉溶媒，高溫高壓滅菌30min后，分裝備用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多重干細(xì)胞復(fù)合凍干粉及溶媒的制備方法，其特征在于：所述DMEM-LG細(xì)胞培養(yǎng)液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL和兩性霉素B 1μg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多重干細(xì)胞復(fù)合凍干粉及溶媒的制備方法，其特征在于：步驟⑴中所述無(wú)抗生素DMEM-LG培養(yǎng)基含10％FBS、bFGF 5ng/mL和L-谷氨酰胺2mM。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多重干細(xì)胞復(fù)合凍干粉及溶媒的制備方法，其特征在于：所述凍干機(jī)為真空凍干機(jī)。