[發明專利]一種纖維素酶突變體及其高產菌株

有效

• 申請號: 201810091774.8
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN110093332B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 劉艷萍;張青;許麗紅;吳佳鵬;黃亦鈞;王華明
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;濰坊康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N1/15;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明涉及基因工程技術領域，具體提供了一種纖維素酶突變體及其高產菌株。所述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO：4。本發明還提供了一種里氏木霉突變菌株，其保藏編號為CCTCC NO:M2017841。本發明提供的纖維素酶突變體的最適作用溫度為60℃，最適作用pH為6.0，且在pH 5.5?7.0范圍內均能保持80％以上的酶活水平。與野生型纖維素酶NCE4相比，纖維素酶突變體的耐熱性得到顯著提高。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種纖維素酶突變體及其高產菌株。

背景技術

纖維素酶是將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單種酶，主要包括三個組分：內切葡聚糖酶(Endoglucanase，EG)、纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase，CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)。纖維素酶在降解纖維素的過程中，三種酶發揮了協同催化的作用。纖維素酶的應用領域是十分廣泛的，涉及紡織、釀造、食品、造紙、飼料等，不同的應用領域對纖維素酶各組分的需求也是不同的。在適當的條件下，它們協同作用，將天然纖維素水解成葡萄糖。

上世紀80年代末，纖維素酶作為一種生物酶制劑開始進入紡織行業，而且得到了迅速的發展。纖維素酶用于紡織工業具有許多的優點：首先，作為一種生物催化劑，它無毒無害；其次，處理需要的條件比較溫和，且酶的用量少；最后，處理反應后的廢水無污染，可以節約能量。

纖維素酶能作用于天然或再生纖維素纖維，包括棉、麻、竹纖維、構木纖維、粘膠纖維、銅氨纖維和Lyocell纖維等，纖維素酶對織物減量處理后，可去掉織物表面茸毛，使織物光潔、明亮、柔軟，打光并減少起球現象。根據處理的目的不同，可進行生物拋光、柔軟減量、改善光澤以及石磨水洗等加工。

纖維素酶是多種酶的混合物，酶成分的表征對于了解和控制酶整理的效果是必不可少的。從目前研究結果看，EGⅡ酶在減量處理、生物拋光處理、水洗和石磨處理性能均十分優良，是非常重要的纖維素酶組分。同時，溫度、PH值、表面活性劑、無機鹽、機械攪拌、超聲波協同等因素都會影響纖維素酶處理的效果。因此，對不同的纖維素酶品種，不同的纖維要選擇合理的工藝條件，才能使酶處理的效果最佳。

目前在許多相關的研究中，為了得到更佳的酶，除了從自然界中篩選出來之外，就是將現有的酶蛋白加以改造。目前主要有兩大改造策略，其一是隨機突變或將酶基因隨機排列，在特定的作用條件下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。另一種改造策略則是通過研究酶結構與作用機制找出對于酶活性或特性具有關鍵性的氨基酸，并針對這些特定氨基酸進行突變并測試，進而得到功能性更強的改造酶蛋白。

本發明通過定點突變的方式獲得一種耐溫性能得到顯著提高的纖維素酶突變體，以滿足纖維素酶在紡織工業中的應用需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種纖維素酶突變體及其高產菌株。本發明通過對來源于特異腐質霉(Humicola insolens)的纖維素酶NCE4進行蛋白質工程改造，獲得了突變體蛋白，其在紡織除毛和水洗中的應用效果得到顯著的提升，其熱穩定性也得到明顯提高，可廣泛應用于紡織工業領域。

本發明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO：1的纖維素酶的第219-235位氨基酸發生缺失。

上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID NO：4。

本發明另一方面提供了攜帶有上述纖維素酶突變體基因的重組質粒。

本發明還涉及一種里氏木霉(Trichoderma reesei)工程菌株，其攜帶有上述的重組質粒。

本發明還提供另一種里氏木霉工程菌株，是以上述里氏木霉工程菌為出發菌株，通過過量表達轉錄正調控因子Hap2得到的；所述轉錄正調控因子Hap2的基因序列為SEQ IDNO：5。