[發(fā)明專利]腸上皮類器官無生長因子培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810083614.9
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108085296B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 陳曄光;李葉華;劉媛
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發(fā)明提出了一種培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基包括：基礎培養(yǎng)基、血清替代物、雙抗、谷氨酸鹽/酯、N?乙酰半胱氨酸、CHIR?99021以及LDN?193189。利用根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)腸隱窩或腸干細胞，獲得的腸隱窩的數量多于現有技術，獲得的腸隱窩中的干細胞的比例更高，獲得的腸干細胞的數量更多；并且利用根據本年發(fā)明實施例的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)腸隱窩，可以長時間維持腸隱窩中的干細胞的干性，腸隱窩中細胞增殖更加旺盛，腸隱窩中細胞分化正常有序。根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基利于腸上皮干細胞培養(yǎng)系統和腸隱窩類器官培養(yǎng)系統的推廣，有利于腸干細胞在體外大量擴增，進而為腸道疾病的治療提供了非常有利的平臺。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地，本發(fā)明涉及培養(yǎng)基及其用途，更具體地，本發(fā)明涉及培養(yǎng)基、CHIR-99021以及LDN-193189在制備培養(yǎng)基中的用途、培養(yǎng)腸隱窩的方法以及獲得腸干細胞的方法。

背景技術

腸上皮是人體執(zhí)行消化吸收功能的主要結構，它更新十分迅速，而它的更新主要是由位于其底部隱窩結構中的腸上皮干細胞所驅動的，因而對腸干細胞的研究與人體健康息息相關。近年來，腸上皮干細胞體外培養(yǎng)系統的建立大大推動了對腸上皮干細胞的研究，便于在體外直接對腸上皮干細胞進行操作和觀察。這些體外培養(yǎng)的腸上皮干細胞還可以整合進入損傷后的腸上皮，幫助修復腸上皮的損傷，有希望被應用于腸道損傷疾病的治療。

在進行小鼠小腸上皮類器官培養(yǎng)時，使用的培養(yǎng)條件為：基礎培養(yǎng)基AdvancedDMEM/F12、血清替代物N2和B27、雙抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine,以及所需要的生長因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1。在進行單細胞培養(yǎng)時，需要在類器官培養(yǎng)基的基礎上加入10uM的Blebbistatin和100ng/mL的Wnt-3a。進行小鼠結腸類器官體外培養(yǎng)時，需要在小腸培養(yǎng)基的基礎上加入100ng/mL的Wnt-3a。進行人的小腸培養(yǎng)時需要在小鼠小腸隱窩培養(yǎng)基的基礎上加入100ng/mL的Wnt-3a，500nM的A83-01，10uM的SB202190，1M的Nicotinamide和100uM的[Leu15]-Gastrin I。

現存的腸干細胞體外培養(yǎng)系統需要加入EGF、Noggin和R-spondin(ENR)或者ENR和Wnt-3a(ENRW)等生長因子，這些生長因子價格昂貴，不利于腸上皮干細胞培養(yǎng)系統的推廣，尤其是限制了腸干細胞在體外大量擴增，用于腸道疾病的治療。

發(fā)明內容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。

為此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種培養(yǎng)基。根據本發(fā)明的實施例，所述培養(yǎng)基包括：基礎培養(yǎng)基、血清替代物、雙抗、谷氨酸鹽/酯、N-乙酰半胱氨酸、CHIR-99021以及LDN-193189。根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基采用CHIR-99021和LDN-193189替代EGF、Noggin、R-spondin和Wnt-3a等生長因子，成本較低，為不含生長因子的腸干細胞或隱窩培養(yǎng)；并且根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基可以通用于小腸隱窩、結腸隱窩、單細胞以及人鼠小腸隱窩培養(yǎng)，方便操作。更為重要的是，發(fā)明人發(fā)現，利用根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)腸隱窩或腸干細胞，獲得的腸隱窩的數量多于現有技術，獲得的腸隱窩中的干細胞的比例更高，獲得的腸干細胞的數量更多；并且利用根據本年發(fā)明實施例的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)腸隱窩，可以長時間維持腸隱窩中的干細胞的干性，腸隱窩中細胞增殖更加旺盛，腸隱窩中細胞分化正常有序。根據本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基利于腸上皮干細胞培養(yǎng)系統和腸隱窩類器官培養(yǎng)系統的推廣，有利于腸干細胞在體外大量擴增，進而為腸道疾病的治療提供了非常有利的平臺。

根據本發(fā)明的實施例，上述培養(yǎng)基還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發(fā)明的實施例，所述CHIR-99021的濃度為7～15μM，所述LDN-193189的濃度為100～500nM。進而培養(yǎng)基用于腸隱窩或腸干細胞的體外培養(yǎng)效率進一步提高。