[發明專利]基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法

有效

• 申請號: 201810081322.1
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108280321B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 孫立新;王華;劉翠釵;王芳;劉敏;劉希;張辰辰
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: G16C20/50
• 分類號: G16C20/50;G16C20/30
• 代理公司: 沈陽飛揚靈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 21255
• 代理人: 靳玲

1.基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法，其特征在于：采用LC-MS/MS技術分析12種腫瘤細胞在給予臨床上常用的破壞DNA結構類，抗代謝類，干擾RNA合成類和影響微管蛋白類4類抗腫瘤藥后細胞內代謝物的變化，經多元統計分析找出與藥物作用機制相關的52個差異代謝物，應用化學計量學方法建立基于這四類作用機制的預測模型；包括如下步驟：

1)12種腫瘤細胞系選擇

2)選擇4類不同作用機制的抗腫瘤藥物對12種腫瘤細胞系分別孵育每份樣品平行制備4份，靜置培養，液氮淬滅后收集細胞團，制備分析用樣品；

3)細胞樣品提取

4)UPLC-MS/MS樣品分析方法

色譜柱采用C18色譜柱，柱溫為25-50℃；流動相為A和B的組合，其中，流動相A為含0.05-0.3％甲酸的水，流動相B為含0.05-0.3％甲酸的乙腈，梯度洗脫，流動相B：15-90％，流動相A：85-10％；流速為0.15-0.4ml/min；進樣體積為2-8μl；離子源溫度為120℃；毛細管電壓為2.5-3.5kV；錐孔壓為25-50V；脫溶劑氣流速為600L/h；脫溶劑氣溫度為350℃；質荷比m/z掃描范圍為124-1000Da；

5)HILIC-MS/MS樣品分析方法

色譜柱為HILIC色譜柱，柱溫為25-50℃；流速為0.15-0.4ml/min；流動相為A和B的組合，其中，流動相A為含0.05-0.3％甲酸的水，流動相B為含0.05-0.3％甲酸的乙腈，梯度洗脫，流動相B：95-60％，流動相A：5-40％；進樣體積為2-8μl；離子源溫度為120℃；毛細管電壓為2.5-3.5kV；錐孔壓為25-50V；脫溶劑氣流速為600L/h；脫溶劑氣溫度為350℃；m/z質荷比掃描范圍為80-1000Da；

6)數據處理

將所得數據通過MarkerLynx軟件進行濾噪、峰對齊、峰檢測、降維處理；所得數據參照80％規則排除零值的累計次數超過20％變量，將獲得的二維數據陣文件導入SIMCA軟件，進行多元統計分析，采用主成分分析，觀察各組數據的聚類與離群樣品，剔除異常樣品點，采用正交偏最小二乘判別分析篩選與藥物作用機制相關的差異代謝物；

7)建立預測模型

以不同作用機制抗腫瘤藥物所得數據為基礎，建立基于這四種作用機制的OPLS-DA預測模型；

8)模型驗證

采用非建模抗腫瘤藥物對數學模型的預測準確性進行驗證；

9)模型應用

采用建立的模型對2種天然化合物的抗腫瘤機制進行預測。

2.根據權利要求1所述的基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法，其特征在于：所述抗腫瘤藥物為：表柔比星、柔紅霉素、放線菌素-D、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、順鉑、絲裂霉素、依托泊苷、紫杉醇，多西他賽、長春新堿。

3.根據權利要求1所述的基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法，其特征在于：步驟2)中藥物作用時間為24-72h，細胞淬滅方法為液氮淬滅刮板法，細胞團用甲醇和二氯甲烷兩步提取后，用一種結合RP-UPLC-MS/MS和HILIC-UPLC-MS/MS的液質聯用分析方法進行分析。

4.根據權利要求1所述的基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法，其特征在于：所述的12種腫瘤細胞為人宮頸癌Hela細胞，人肝癌HepG2細胞，人口腔癌KB細胞，人乳腺癌MCF7細胞，人乳腺癌T47D細胞，人胃癌SGC7901細胞，人成纖維肉瘤HT1080細胞，人卵巢癌SKOV3細胞，人前列腺癌PC3細胞，人前列腺癌DU145細胞，人肺癌A549細胞，人橫紋肌肉瘤A204細胞。

5.根據權利要求1所述的基于細胞代謝輪廓分析構建抗腫瘤候選化合物作用機制預測模型的方法，其特征在于：所述的破壞DNA結構類，抗代謝類，干擾RNA合成類和影響微管蛋白類抗腫瘤藥物中，分別篩選出17,11,12和12種代謝物與該四類藥物的作用機制密切相關。