[發明專利]一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌及其疫苗

有效

• 申請號: 201810073350.9
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108018253B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 曾海娟;劉箐;王淑娟
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供了一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基礎上，再缺失dal與dat基因。上述的一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌的保藏號為CGMCC NO：14611。本發明還提供了上述的減毒單核細胞增生李斯特氏菌作為疫苗的用途。本發明的單增李斯特氏菌的減毒疫苗，由于采用了基因敲除技術對兩個毒力基因及兩個生長相關基因的敲除，保證了減毒菌株的安全性。實驗結果表明，該疫苗具有良好的免疫原性，能引起細胞多種免疫因子產生，并能產生較高的免疫保護效果。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種單增李斯特氏菌，具體來說是一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌、及其疫苗。

背景技術

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一種重要的食源性致病菌，在自然環境中廣泛分布。Lm具有較強的生存能力，pH在4.5–9，溫度在0-45℃均可增殖，在干酪、原奶、冰淇淋、生肉、海鮮及方便食品，如：熟肉、熏魚中均有檢出。單增李斯特氏菌可穿透腸道屏障、胎盤屏障和血腦屏障，引起哺乳動物和人的腸胃炎、敗血癥、孕畜流產及腦膜炎等。超過99％的單增李斯特氏菌感染是由于食用了被該菌污染的食物，死亡率達30％以上。單增李斯特氏菌是典型的胞內寄生菌，它可通過李斯特氏菌溶血素、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C和卵磷脂酶的裂解作用下逃離吞噬小體，并在細胞質中增殖。

目前，國內對致病菌的防治方法相對落后，主要依賴大規模使用抗生素，但抗生素的使用導致微生物產生耐藥性，并可能使食品存在藥物殘留。研究發現，金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率達33.3％，副溶血性弧菌對四環素和復方磺胺甲惡唑耐藥率分別為2.1％和3.2％，沙門菌對萘啶酸的耐藥率為50％。研發高效疫苗，通過免疫途徑提高動物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是預防致病菌感染的有效途徑。

D-丙氨酸(D-Ala)，為細菌細胞壁肽聚糖的重要組成成分。在單核細胞增生李斯特氏菌中，存在兩種途徑生成D-Ala：基因dal編碼丙氨酸消旋酶(Alr)，可將L-Ala轉化為D-Ala；基因dat編碼D-氨基酸氨基轉移酶蛋白，可將D-谷氨酸與丙酮酸通過轉氨作用生成D-Ala與α-酮戊二酸，當dal與dat基因全部缺失時，由于不能合成D-Ala，在無外源D-Ala添加時，該dal/dat雙基因缺失菌株將發生溶菌死亡。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌、及其疫苗，所述的這種減毒單核細胞增生李斯特氏菌、及其疫苗要解決現有技術中抗生素濫用導致環境污染及食品抗生素殘留的問題。

本發明提供了一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基礎上，再缺失dal與dat基因。

進一步的，上述的一種減毒單核細胞增生李斯特氏菌的保藏號為CGMCC NO：14611。

本發明還提供了上述的減毒單核細胞增生李斯特氏菌作為疫苗的用途。

本發明以單核細胞增生李斯特氏菌野生株EGDe actA及inlB雙毒力基因缺失株(EGDeΔactA/inlB)為親本，利用同源重組的方法進一步構建缺失了基因dal及dat的菌株(EGDeΔactA/inlB/dal/dat，EGDeΔABdd)。實驗驗證該缺失株在無外源D-丙氨酸添加時，在正常的培養基及環境下不能生長繁殖，需添加外源D-丙氨酸才能生長繁殖。相關細胞及動物實驗表明，該缺失菌株具有良好的安全性及免疫原性，可作為一株新型的減毒單增李斯特氏菌疫苗。

本發明提供的單增李斯特氏菌基因actA/inlB/dal/dat的敲除株，是通過單增李斯特氏菌基因敲除載體pKSV7分別敲除actA/inlB/dal/dat四個基因得到。