[發明專利]一種磁珠法細菌基因組DNA提取試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201810061626.1
• 申請日: 2018-01-23
• 公開（公告）號: CN108220284A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 趙大顯;簡少卿;張翠真;陳志和;毛振方;程海燕;陳娟
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

一種磁珠法細菌基因組DNA提取試劑盒及應用，屬于分子生物學技術領域。該試劑盒包括以下六種組分：磁珠懸液A、緩沖液B、緩沖液C、緩沖液D、緩沖液E和洗脫液。該試劑盒提取方法包括以下四個步驟：細菌裂解、磁珠吸附、洗滌、洗脫。本發明試劑盒采用單分散、超順磁性硅羥基納米磁珠，配合獨特的緩沖液系統，提取出來的細菌基因組DNA濃度大、純度高、完整性好。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種DNA提取試劑盒。

背景技術

基因組DNA的提取是分了生物學研究的一個重要環節，是進行幾乎所有核酸檢測的基礎。傳統的細菌基因組DNA提取方法有酚—氯仿抽提法、鹽析法和離心柱法等。這些方法均存在一些缺點，例如：酚—氯仿抽提法要使用到酚和氯仿等有毒物質，對人體有害，且容易造成環境污染；鹽析法提取的DNA純度低。硅膠膜吸附柱法提取的DNA濃度低。

傳統細菌基因組DNA提取方法同時提取過程需要反復換管、離心、分液，步驟繁瑣，提取工作效率低下，并且會造成樣本的丟失與污染。此外。傳統的方法實現自動化困難、單位時間通量低、既費時又繁瑣，遠遠不適用于核酸自動化檢測。近年來，基于納米材料的基因組DNA分離技術得到了快速發展，而納米磁珠由于具有分散性好、易于功能化、易于自動化的優點使之成為非常合適的基因組DNA制備載體。應用表面修飾了功能基團的納米磁珠和合適的緩沖液系統，能夠快速、高效地從細菌中提取基因組DNA。具有自動化升級的潛力，使得核酸提取的大規模集成化，均一化成為可能。

由于細菌中存在大量的蛋白質和RNA，現有的磁珠法提取的細菌基因組DNA由于沒有去除蛋白質和RNA等雜質的步驟，提取到的基因組DNA得率低、純度低。

發明內容

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種磁珠法細菌基因組DNA提取試劑盒，利用該試劑盒提取的細菌基因組DNA片段完整，純度高，無蛋白質和RNA污染，并且得率高。

為了實現上述目的，本發明采取以下技術方案。

本發明所述的一種磁珠法細菌基因組DNA提取試劑盒，包括磁珠懸液A、緩沖液B、緩沖液C、緩沖液D、緩沖液E、洗脫液六種組分。

所述磁珠懸液A中使用的磁珠為單分散、超順磁性硅羥基納米磁珠，磁珠粒徑300-500nm，濃度100mg/mL，磁珠懸浮在20%的乙醇中。

所述緩沖液B終濃度組成為：2-5mol/L鹽酸胍、1-2%月桂酰肌氨酸鈉、200-500μg/mL核糖核酸酶A（RNase A）、0.05-0.1mol/L檸檬酸鈉，溶劑為無菌去離子水，緩沖液B pH為6.5-8.0。核糖核酸酶A可以快速有效的降解體系中的RNA，去除RNA污染，同時增加磁珠對DNA的吸附量。

所述緩沖液C終濃度組成為：1-2mol/L異硫氰酸胍、60-80%異丙醇、1-5%聚乙二醇、0.02-0.05mol/L檸檬酸鈉，溶劑為無菌去離子水，緩沖液C pH為5.5-7.5。緩沖液C為清洗液，其中的異硫氰酸胍能夠使體系中的蛋白質迅速變性而與DNA分離，達到清除蛋白質的目的。

所述緩沖液D終濃度組成為：1-2mol/L醋酸鈉、5-8%聚乙二醇，溶劑為無菌去離子水，緩沖液D pH為5.0-6.0。

所述緩沖液E終濃度組成為：0.05-0.1mol/L氯化鈉、60-80%乙醇、10mmol/L三羥甲基氨基甲烷，溶劑為無菌去離子水，緩沖液D pH為7.0-7.5。

所述洗脫液為：無菌去離子水或10mmol/L三羥甲基氨基甲烷，洗脫液pH為7.0-8.0。

本發明所述的試劑盒提取細菌基因組DNA包括細菌裂解、磁珠吸附、洗滌、洗脫步驟，具體如下。

步驟一，向離心管中加入100-500μL細菌培養液，然后加入初始菌液相同體積的緩沖液B，混勻，裂解15分鐘。