[發明專利]一種熱穩定性提高的果聚糖蔗糖酶突變體

有效

• 申請號: 201810060609.6
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108018269B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 沐萬孟;張文立;徐煒;江波;張濤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/02;C12P19/04;C12P19/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種熱穩定性提高的果聚糖蔗糖酶突變體，屬于酶工程技術領域。本發明將來源于微生物Brenneria sp.EniD312的果聚糖蔗糖酶作為親本，利用基因突變技術，將其404位的谷氨酸Glu替換成色氨酸Trp，獲得單突變體酶E404W；在最適催化條件下，酶催化底物蔗糖合成β?(2,1)果聚糖levan的總酶活在35℃的半衰期由原來的4h提高到52h，45℃的半衰期由原來的2.1h提高到12.5h，55℃的半衰期由原來的42min提高到104min，這一發現對于工業化制備果聚糖levan具有重要的研究價值。

技術領域

本發明涉及一種熱穩定性提高的果聚糖蔗糖酶突變體，屬于酶工程技術領域。

背景技術

果聚糖(fructan)是自然界普遍存在的一種主要由果糖基連接成的碳水化合物的總稱。研究結果表明每一種果聚糖分子中都含有一分子葡萄糖，其分子末端沒有還原性。果聚糖廣泛存在于自然界的一些有機體中：細菌、真菌和大約15％的開花植物。由于果糖基連接位置的不同以及物種間聚合度的差異，果聚糖的結構相當復雜。根據連接方式的不同可將果聚糖主要分為兩大類：(1)levan果聚糖：主要以β-(2,6)鍵連接，這一類型的果聚糖主要存在于細菌和單子葉植物中；(2)菊糖：主要以β-(2,1)鍵連接，這一類型的果聚糖主要存在于雙子葉植物中。菊糖雖然大量存在于植物中，提取較方便，但是菊糖的溶解性比levan果聚糖差，這就限制了它的應用。研究表明，植物中的果聚糖主要分布在細胞液泡中，可以調節滲透壓，提高植株的耐旱能力還可以起到液泡滲透緩沖劑和低溫保護劑的作用。另外，植物中果聚糖的積累還與植物耐鹽、耐重金屬毒害、耐缺氧、耐營養不良有關。細菌果聚糖是由微生物利用蔗糖生物合成的，它可以保護細胞，防止失水。隨著藥物化學和糖生物學等相關學科的發展，果聚糖所表現出來的功能和特性，尤其是在抗腫瘤、增加免疫力以及抗菌等方面將會得到越來越多的關注，這可為開發新型的抗癌藥和抗菌藥等提供新的途徑。

果聚糖蔗糖酶是糖基轉移酶家族中的一員，屬于己糖基轉移酶的一類。它具有轉糖基活性，可以以蔗糖為底物，生成大分子量的果糖聚合物—levan果聚糖，同時還具有水解活性，能將蔗糖水解為葡萄糖和果糖。在酶學研究中，果聚糖蔗糖酶是一種可以催化以下化學反應的酶：

蔗糖+(2,6-β-D-果糖基)_n≒葡萄糖+(2,6-β-D-果糖基)_n+1

大部分已發現的細菌所產的果聚糖蔗糖酶為胞外酶，且它們之間差異很大，其中只有很少一部分果聚糖蔗糖酶被研究的很清楚。

自1999年Raj首次從運動單胞菌屬Zymomonas mobilis中發現了一種具有合成果聚糖能力的果聚糖蔗糖酶開始，使用生物轉化法制備果聚糖的研究已經有10余年的歷史。迄今為止，已發現幾種微生物可以產生此酶，包括Bacillus methylotrophicus，Bacilluslicheniformis,Geobacillus stearothermophilus，Bacillus amyloliquefaciens，Lactobacillus reuteri，Lactobacillus panis，Lactobacillus sanfranciscensis。近年來，對于果聚糖蔗糖酶的研究熱點集中在酶的性質鑒定及產物levan長短鏈延長機制方面，因此為了獲得更適合的生物催化劑，通過定點突變的辦法，對來自微生物Brenneriasp.EniD312的果聚糖蔗糖酶進行分子改造，為進一步提高其催化活性以期得到更適合于工業應用的Brsp-LS酶。

發明內容

本發明的目的是一種熱穩定性提高的果聚糖蔗糖酶的突變體酶E404W，對果聚糖levan的合成具有重要的現實意義。

本發明提供一種熱穩定性提高的果聚糖蔗糖酶的突變體酶E404W，來源于微生物Brenneria sp.EniD312的果聚糖蔗糖酶進行突變得到單突變體酶；將原來Brsp-LS酶中的第404位的谷氨酸Glu替換成色氨酸Trp，獲得單突變體酶E404W。