[發明專利]篩選甲基化PCR檢測的目標區域的方法、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201810059375.3
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108410980B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 葉明芝;鄭春婷;曾柳紅;李志隆;宋炎;茅矛
• 申請（專利權）人: 華大數極生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

本申請公開了一種篩選甲基化PCR檢測的目標區域的方法、試劑盒及應用。本申請的方法包括(1)從數據庫中獲取待分析腫瘤甲基化芯片及對應轉錄組測序數據；(2)統計正常組與癌癥組的甲基化程度值，篩選不同組別中具有顯著差異的甲基化位點；(3)聯合轉錄組測序表達譜的分析，統計相關系數，篩選負相關位點；(4)將步驟(3)獲取的甲基化候選位點，與披露的相關文獻關聯，篩選獲得文獻支持報道多且組間甲基化差異程度大、表達量負相關位點；使用回歸算法，獲取最佳敏感性、特異性的位點集合，即目標區域。本申請的方法，綜合分析數據庫、轉錄組測序和文獻，并結合多重數據過濾和回歸算法，能靈敏、特異的獲得甲基化PCR檢測目標區域。

技術領域

本申請涉及核酸甲基化PCR檢測領域，特別是涉及一種篩選甲基化PCR檢測的目標區域的方法、試劑盒及應用。

背景技術

DNA的異常甲基化和基因突變是腫瘤發生與發展的重要原因，前者可能在腫瘤的超早期就已發生，是促進腫瘤生長的“種子”因素。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸相連的C堿基上。CpG以兩種形式存在，一種分散于DNA高度或中度重復序列中，如Alu；另一種CpG高度聚集，形成CpG島(縮寫CGI)，位于基因的5’端啟動子區域，也可延伸至基因的外顯子區。研究表明，基因組啟動子區的甲基化，是導致癌癥發生的重要分子改變之一，隨著癌癥的進展，甲基化也呈現動態改變的趨勢；此外，不同種類的癌癥的甲基化圖譜也存在明顯的差異；用這一特點，可以展開基于甲基化檢測的腫瘤早期篩查應用。CpG島中的CpG通常處于非甲基化狀態，其異常甲基化與癌癥密切相關，是研究和檢測基因甲基化狀態的關鍵區域。甲基化一般都是連續發生的，即某一CpG位點發生甲基化，那么該位點上下游一定區域內的CpG也相應的發生甲基化。

甲基化的檢測主要關注基因啟動子區的CpG島相關區域，包括CpG島(約1kb的區域)及其兩側的shore(即島兩側約2kb)和shelf(島兩側2～4kb的區域)，總共約9kb的區域，檢測手段有甲基化PCR和甲基化測序技術。

甲基化PCR快速簡便，是檢測熱點區域甲基化狀態的有效手段。甲基化PCR是將模板DNA進行亞硫酸氫鹽轉化后，將DNA序列中的非甲基化的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)，而甲基化胞嘧啶(5mC)保持不變，根據轉化后的DNA序列中胞嘧啶位點的C-U轉化差異設計相應的甲基化和非甲基化引物進行PCR擴增，結合凝膠電泳或qPCR熒光曲線等檢測手段，記錄轉化后模板DNA是否得以擴增，來判斷原始模板DNA是否甲基化。若經亞硫酸氫鹽轉化后的模板DNA用甲基化引物能夠擴增而非甲基化引物不能擴增，說明原始模板在此處為全甲基化；反之說明原始模板為全非甲基化；若轉化后的模板DNA用甲基化和非甲基化引物均能夠擴增，說明原始模板在此處為部分甲基化。甲基化PCR主要有兩種設計思路：一、設計甲基化引物對轉化后模板DNA進行擴增，結合凝膠電泳條帶分析；二、在待測區域兩邊設計普通PCR引物，而在待測區域內設計熒光探針，用熒光PCR擴增曲線記錄轉化后模板DNA的擴增情況，根據Ct值分析原始模板的甲基化狀態。

甲基化測序技術可測全基因組范圍內CpG的甲基化狀態，如WGBS全基因組重亞硫酸鹽測序，RRBS簡化表觀亞硫酸氫鹽測序，MeDIP甲基化DNA免疫共沉淀測序等，也可用引物或探針捕獲特定區域后，通過不同的測序技術，例如sanger或焦磷酸測序，檢測目的區域內的CpG位點甲基化狀態。測序技術可檢測范圍廣，通量較高，信息較全面；但測序耗時較長，需要測序設備及數據解讀平臺和時間，費用相對較高，不利于臨床推廣。

甲基化檢測覆蓋范圍可分為大、中、小三個維度，大范圍的檢測主要是全基因組甲基化測序技術，檢測位點廣泛但費用相對較高；中等覆蓋度的檢測可用芯片捕獲測序技術，可實現對熱點的針對性檢測，節約成本；小范圍的檢測用甲基化特異性PCR技術，可實現對數個熱點甲基化狀態的快速、靈敏檢測，不需測序，費用相對低。目前應用最多的是后兩種檢測方法，這兩種方法都需要從基因組范圍內篩選熱點區域，從而設計探針或引物，有針對性的檢測目標區域的甲基化狀態。熱點區域的篩選，即biomarker篩選，又或者稱為目標區域或目標位點的篩選，對于甲基化PCR檢測和探針捕獲測序都尤其重要。