[發明專利]一種特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統及其應用

在審

• 申請號: 201810048910.5
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108261395A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 王志遠;張歡歡;余陳歡;俞文英;方杰;謝琿;鐘宇森;應華忠
• 申請（專利權）人: 浙江省醫學科學院
• 主分類號: A61K9/127
• 分類號: A61K9/127;A61K31/7105;A61K47/26;A61K48/00;A61P5/50
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

一種特異性靶向FOXO1基因的CRISPR?Cas納米載藥系統及其應用，屬于基因工程及生物醫藥技術領域。本發明一方面提供了一種特異性靶向FOXO1基因的CRISPR?Cas納米載藥系統，另一方面提供了該系統在制備用于治療代謝性疾病藥物中的應用。

技術領域

本發明屬于基因工程及生物醫藥技術領域，具體涉及一種特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統及其應用。

背景技術

胰島素抵抗是代謝綜合征患者（包括脂肪肝和2型糖尿?。┲匾牟±硖卣髦?，這些患者胰島β細胞分泌胰島素的功能可能是正常甚至是偏高的，但是胰島素作用的靶細胞不能識別胰島素，引起一系列代謝的紊亂?，F代研究表明，胰島素抵抗與叉頭框蛋白(forkhead box O，FOXO)之間相互影響。FOXO是Forkhead蛋白家族的一個亞群，是一類重要的轉錄因子。其中，FOXO1是FOXO家族的成員之一，可廣泛作用于脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞、胰島β細胞等多種細胞，參與調控細胞的增殖與分化、自噬、以及線粒體功能，并且可以參與胰島素的合成以及胰島素對肝細胞糖脂代謝的調節。在胰島素抵抗的條件下，FOXO1的磷酸化水平降低，核轉錄活性增強。但FOXO1的活性增強對胰島素抵抗的作用是雙重性的。一方面FOXO1的核定位增強，可促進核轉錄因子核因子-KB(nuclear factor kappa B，NF—KB)的表達增加，白介素-1β(intedeukin-1 beta，IL-1β)等炎癥因子的表達水平也增加，促進胰島β細胞的凋亡，加重病情；另一方面，FOXO1可促進其靶基因IRS-1和IRS-2的表達，提高胰島素敏感性。因此，特異性的調控FOXO1活性，僅提高其抗胰島素抵抗作用，是目前生物醫藥技術的難點。

在過去幾年中，以ZFN (zinc-finger nucleases)和TALEN (transcriptionactivator-like effector nucleases)為代表的序列特異性核酸酶技術以其能夠高效率地進行定點基因組編輯，在基礎研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。而CRISPR/Cas技術自2012年問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，經技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因，且具有脫靶率低、無物種限制等優勢，已被廣泛用于人類疾病機制相關研究中。目前，借助實驗動物模型，應用基因編輯技術治療相關疾病的研究也已屢見不鮮；科學家們已經可以通過體細胞修飾治療個體自身遺傳?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀⒅委熀皖A防個體自身基因引起的疾?。ㄈ缛橄侔┖吐殉舶┛蓜h除BRCA基因）和感染性疾病（如將插入細胞核內的艾滋病病毒的DNA刪除），并逐步向臨床應用轉化。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統及其應用的技術方案。

所述的特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統，其特征在于包含靶向FOXO1基因的sgRNA、核酸酶Cas的mRNA和納米載藥系統。

所述的特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統，其特征在于所述的靶向FOXO1基因的sgRNA包含但不限于以下序列：sgFOXO1-1、sgFOXO1-2和sgFOXO1-3，所述的sgFOXO1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sgFOXO1-2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述的sgFOXO1-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統，其特征在于所述的核酸酶Cas的mRNA由體外轉錄制備或直接合成，所述核酸酶Cas優選但不局限于Cas9蛋白。

所述的特異性靶向FOXO1基因的CRISPR-Cas納米載藥系統，其特征在于所述的納米載藥系統含有氫化磷脂、膽固醇（2,3-二油酰基-丙基）-三甲胺（DOTAP）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和C16 Cer-PEG。