[發(fā)明專利]一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810040774.5
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108250295A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王航;張蕓;孟春;高蕊;陳思詩
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/00
• 代理公司: 福州君誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發(fā)明公開一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，包括以下步驟：ERα蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔及脾臟總RNA提取；RT?PCR擴增VH和VL片段及scFv基因拼接；構(gòu)建PCANTAB5E?ScFv重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫；ERα陽性的乳腺癌組織切片和ERα蛋白作為固相化抗原對抗體庫進行親和富集篩選；采用Phage?ElLSA法和乳腺癌細(xì)胞涂片免疫化學(xué)相結(jié)合的方法鑒定陽性克隆子。本發(fā)明建立了一種利用ERα陽性乳腺癌組織切片對噬菌體抗體庫進行雌激素受體特異性篩選的方法，并利用phage?ElLSA法和乳腺癌細(xì)胞涂片免疫化學(xué)相結(jié)合的方法來鑒定陽性克隆子，為噬菌體抗體庫的篩選方法提供了新的思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于噬菌體抗體庫篩選方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法。

背景技術(shù)

雌激素受體(estrogen receptor,ER)作為一種生物標(biāo)志物，它既是屬核激素受體(nuclear receptor,NR)蛋白的一種，又是屬于具有激活功能的轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)的ER具有ERα、ERβ、ERγ三種亞型。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)雌激素受體α(ERα)在大約70％的乳腺癌病例中都表現(xiàn)出高表達(dá)和高活性水平。ERa的表達(dá)與乳腺癌密切相關(guān)，特別是腫瘤的發(fā)展。例如，乳腺癌治療中降低ERα表達(dá)往往會有更好的治療效果。ER表達(dá)水平與內(nèi)分泌治療的療效密切相關(guān)，ER檢測有助于預(yù)測患者對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)，其檢測結(jié)果將直接決定治療方案的選擇。準(zhǔn)確檢測和報告ER狀態(tài)對乳腺癌的臨床治療和預(yù)后判斷非常重要，已成為乳腺癌病理診斷報告中必不可少的內(nèi)容。免疫組織化學(xué)是目前ER檢測的最佳方法。

美國博士Smithm在1985年第一次將外源蛋白的抗原基因序列通過基因工程技術(shù)組裝在噬菌體內(nèi)部，隨著噬菌體侵染宿主菌完成自我組裝，噬菌體的外殼表面展示出了蛋白抗原決定簇(與噬菌體次要外殼蛋白PIII融合表達(dá))，同時提出了噬菌體展示技術(shù)的概念。現(xiàn)如今噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成為了篩選目的蛋白和目的基因強有力的工具，是一種繼多克隆技術(shù)，單克隆技術(shù)之后更為重要的基因工程技術(shù)。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于篩選多肽和蛋白質(zhì)、抗體等物質(zhì)，具有簡便、高效、低成本等優(yōu)點，該技術(shù)可以從廣泛和隨機的文庫中篩選出與靶標(biāo)蛋白結(jié)合高親和力、高特異性的抗體。

噬菌體抗體庫的淘篩過程是文庫的關(guān)鍵步驟，經(jīng)典的抗原篩選方法即固相篩選，即將純化抗原包被在如酶標(biāo)板、親和層析柱等固相介質(zhì)上篩選一株特異性噬菌體，該方法是將非特異性的噬菌體進行洗脫，特異性的重組噬菌體進行富集的過程。但有時候由于位點封閉不完全，會出現(xiàn)非特異性噬菌體結(jié)合的情況且篩選出的陽性克隆未能在免疫組化結(jié)果上顯現(xiàn)出較好的結(jié)合能力。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α(ERα)單鏈抗體的方法

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，包括以下步驟：

(1)采用雌激素受體α(ERα)蛋白作為免疫原免疫實驗動物新西蘭大白兔，三次免疫結(jié)束后耳緣靜脈取血，采用ELISA法檢測血清效價，效價達(dá)到要求后加強免疫三天后，處死實驗動物，無菌條件下提取脾臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

(2)設(shè)計簡并引物擴增重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL)，采用SOE-PCR拼接VH和VL為scFv基因；

(3)對PCANTAB5E噬菌體質(zhì)粒和scFv基因分別進行雙酶切處理，酶連構(gòu)建PCANTAB-ScFv重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建初級噬菌體單鏈抗體庫，轉(zhuǎn)化液梯度稀釋并涂布2×YT-A平板計算庫容，挑取單克隆菌液PCR計算重組率；