[發明專利]一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法

在審

• 申請號: 201810040774.5
• 申請日: 2018-01-16
• 公開（公告）號: CN108250295A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 王航;張蕓;孟春;高蕊;陳思詩
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/00
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：其包括以下步驟：

（1）采用ERα蛋白作為免疫原免疫實驗動物，三次免疫結束后耳緣靜脈取血，采用ELISA法檢測血清效價，效價達到要求后加強免疫三天后，處死實驗動物，無菌條件下提取脾臟總RNA，逆轉錄合成cDNA；

（2）設計簡并引物擴增重鏈可變區基因VH和輕鏈可變區基因VL，采用SOE-PCR拼接VH和VL為scFv基因；

（3）對PCANTAB5E噬菌體質粒和scFv基因分別進行雙酶切處理，酶連構建PCANTAB-ScFv重組質粒，重組質粒電轉化E.coli TG1感受態細胞構建初級噬菌體單鏈抗體庫，轉化液梯度稀釋并涂布2×YT-A平板計算庫容，挑取單克隆菌液PCR計算重組率；

（4）初級噬菌體單鏈抗體庫與ERα陽性的乳腺癌組織切片一同孵育，進行三輪富集篩選，富集得到的三級噬菌體單鏈抗體庫與結合在固相載體上的ERα蛋白再進行兩輪富集篩選，得到親和力高、特異性強的特異性噬菌體單鏈抗體庫；

（5）特異性噬菌體單鏈抗體庫侵染E.coli TG1，梯度稀釋涂布2×YT-A，挑取單克隆制備噬菌體上清，采用phage-ElLSA法進行初步鑒定，選取OD450較高的單克隆再次制備噬菌體上清，與固定在載玻片上的乳腺癌細胞T47D一同孵育，細胞免疫化學鑒定陽性克隆子。

2.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述實驗動物為新西蘭大白兔。

3.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述ERα蛋白預先經EDTA抗原熱修復處理后再作為免疫原。

4.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（2）中，共設計9對引物擴增VL基因，4對引物擴增VH基因，VL基因和VH基因中間添加一段多肽鏈Linker相連接，所述多肽鏈Linker氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。

5.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（3）中，所述PCANTAB5E噬菌體質粒和scFv基因分別進行sfiI 和NotI雙酶切處理，采用T4DNA電轉專用連接酶連接構建PCANTAB-ScFv重組質粒，電轉化大腸桿菌電轉專用感受態細胞TG1，按照MOi=100:1加入滴度大于10¹²pfu/ml的輔助噬菌體M13KO7，構建初級噬菌體單鏈抗體庫，初級噬菌體單鏈抗體庫采用雙層瓊脂法計算噬菌體滴度，隨機挑取單克隆菌液PCR計算重組率。

6.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（4）中，初級噬菌體單鏈抗體庫與ERα陽性的乳腺癌組織切片一同孵育，棄去未與組織片結合的噬菌體，將結合的噬菌體用Gly-HCL洗脫下來進行擴增，進行三輪富集篩選得到三級噬菌體單鏈抗體庫；三級噬菌體單鏈抗體庫與結合在酶標板上的ERα蛋白一同孵育，增加洗脫次數洗去未結合的噬菌體，最大限度的富集與ERα蛋白結合的噬菌體，進行兩輪富集篩選，得到特異性噬菌體單鏈抗體庫。

7.根據權利要求1所述的一種利用噬菌體抗體庫篩選雌激素受體α單鏈抗體的方法，其特征在于：步驟（5）中，特異性噬菌體單鏈抗體庫侵染E.coli TG1，梯度稀釋涂布2×YT-A，挑取30顆單克隆制備噬菌體上清作為一抗，HRP標記鼠抗M13KO7為二抗，，采用phage-ElLSA法進行初步鑒定，選取OD450較高的7株單克隆再次制備噬菌體上清，與固定在載玻片上乳腺癌細胞T47D一同孵育，HRP標記鼠抗M13KO7為二抗，經DAB染色，蘇木素復染，PBS返藍步驟后，觀察細胞涂片鑒定陽性克隆子。