[發明專利]一種根癌農桿菌介導的平菇菌絲遺傳轉化方法在審
| 申請號： | 201810036306.0 | 申請日： | 2018-01-15 |
| 公開（公告）號： | CN108004262A | 公開（公告）日： | 2018-05-08 |
| 發明（設計）人： | 蔡永萍;焦小雨;李國慶;王燕;金青;聶凡;林毅 | 申請（專利權）人： | 安徽農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/80 | 分類號： | C12N15/80 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 230000 *** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 根癌農 桿菌 菌絲 遺傳 轉化 方法 | ||
1.一種根癌農桿菌介導的平菇菌絲遺傳轉化方法，包括以下步驟：
1)將轉染用質粒載體的啟動子改造為平菇同源啟動子，獲得改造質粒載體；所述轉染用質粒載體為含有兩個CaMV35S啟動子的質粒載體；
2)將步驟1)得到的所述改造質粒載體轉化入根癌農桿菌感受態中，培養1～3d，獲得陽性菌；
3)將步驟2)得到的所述陽性菌侵染平菇菌絲，共培養2～4d，得新長出的菌絲；
4)將步驟3)得到的所述新長出的菌絲接種到含有潮霉素和頭孢霉素的PDA培養基上選擇培養5～7d，分離得到有抗生素抗性的平菇轉化菌株。
2.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于，步驟1)所述改造為將兩個CaMV35S啟動子改造為平菇同源sdi和gpd啟動子。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述改造的步驟包括：
a.質粒載體雙酶切切除第一CaMV35啟動子區，設計帶有酶切位點的引物；
b.利用步驟a所述引物克隆擴增平菇sdi的啟動子基因片段；
c.連接步驟a雙酶切后的質粒載體與步驟b得到的sdi啟動子基因片段，構建質粒載體-SDI質粒；
d.將步驟c構建成功的質粒載體-SDI質粒雙酶切，切除第二CaMV35啟動子區，根據切除第二CaMV35啟動子區后的質粒載體-SDI質粒設計引物；
e.利用步驟d所述引物克隆擴增平菇gpd的啟動子基因片段；
f.連接步驟d所述雙酶切后的質粒載體-SDI載體與步驟e得到的所述gpd啟動子基因片段，得到改造后的質粒載體。
4.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于，步驟2)所述培養為暗培養。
5.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于，步驟3)所述平菇菌絲為菌絲球。
6.根據權利要求5所述的遺傳轉化方法，其特征在于，所述菌絲球的制備方法包括：將平菇菌絲體的菌塊置于PDA液體培養基上接種培養3～4d。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述接種培養的條件包括恒溫搖床，160～200r/min，22～28℃下避光培養。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述共培養用培養基為含有終濃度為200μmol/L的乙酰丁香酮的PDA培養基，所述共培養的條件包括：22～28℃下避光培養。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述選擇培養的條件包括：22～28℃下暗培養。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)得到所述平菇轉化菌株后還包括轉基因鑒定。
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