[發明專利]一種獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體及其應用

有效

• 申請號: 201810036054.1
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108192899B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 陳振;劉德華
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/74;C12N1/21;C12P19/26
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供一種獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體及其應用，屬于微生物基因工程技術領域。本發明將獸疫鏈球菌經NTG誘變引起該菌乳酸脫氫酶基因ldhA發生了一個堿基的突變，697位堿基由A突變為G(A697G)，導致其氨基酸序列的233位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為丙氨酸(T233A)，該基因突變體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，能夠使乳酸脫氫酶酶活降低50％以上，進一步證實含有該基因突變體的獸疫鏈球菌在發酵生產透明質酸的過程中，能夠顯著降低乳酸的積累，乳酸積累量降低60％以上，透明質酸的產量提高50％以上，具有重要的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體及其應用。

背景技術

透明質酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,3及β-1,4糖苷鍵連接而成的高分子多糖類物質，又稱玻尿酸。透明質酸廣泛地存在于人體的各個部位，具有極其重要的生理作用，如協助水電解質的擴散轉運，潤滑關節，調節血管壁的通透性，促進傷口愈合等。另外，透明質酸具有極強的保濕作用，被稱為理想的天然保濕因子。它是目前自然界中發現的化妝品用保濕性能最好的物質。透明質酸具有不同的分子量，其分布從幾千到幾百萬道爾頓，因其分子量的不同，其性能及應用也有所不同。小分子量的透明質酸(分子量10萬)能滲入真皮，容易被人體吸收，因此主要作于保健食品，美容食品及藥物載體領域；中分子量的透明質酸(10萬分子量100萬)能夠緊致肌膚，因此在保濕、面膜、化妝品領域具有廣泛應用；大分子的透明質酸(分子量100萬)，可以作為皮膚填充劑，在美容、醫藥領域具有廣泛的應用。目前全球透明質酸的市場已經超過100億美元。

透明質酸的生產方法主要包括動物組織提取法和微生物發酵法兩種。前者由于來源有限、產率較低等因素，生產成本較高且容易產生免疫反應。因此，目前透明質酸的生產主要是通過發酵法進行。目前，工業上透明質酸的生產菌株主要包括獸疫鏈球菌、馬鏈球菌和類馬鏈球菌等。這類菌株在發酵生產透明質酸的過程當中，同時產生了大量有機酸，特別是乳酸在發酵過程當中大量積累。乳酸的積累一方面極大降低了透明質酸的質量得率，另一方面乳酸會對菌體產生毒害作用，降低透明質酸的終濃度。

發明內容

本發明目的是提供一種獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體及其在提高透明質酸產量中的應用。

本發明首先對獸疫鏈球菌ATCC39920進行亞硝基胍(NTG)誘變處理，篩選能夠提高透明質酸產量的突變菌株，并對突變的菌株進行全基因組測序，并在分子水平上進行驗證。最后獲得一種能夠顯著降低乳酸積累并提高透明質酸產量的獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體。

本發明提供的一種獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體，其為697位堿基由A突變為G，導致其氨基酸序列的233位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為丙氨酸，該基因突變體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明提供的獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發明提供了含有上述獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體的生物材料，所述生物材料為表達載體、表達盒或宿主細胞。

本發明提供了含有上述獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體的工程菌。

所述工程菌包括但不限于重組獸疫鏈球菌、重組馬鏈球菌或重組類馬鏈球菌。

本發明提供了上述獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體在降低乳酸脫氫酶酶活力中的應用。

本發明提供了上述獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體或含有該基因突變體的生物材料或含有該基因突變體的工程菌在制備透明質酸中的應用。

本發明提供了上述獸疫鏈球菌乳酸脫氫酶基因突變體或含有該基因突變體的生物材料或含有該基因突變體的工程菌在發酵領域降低發酵過程中乳酸積累量的應用。