[發明專利]一種立體選擇性提高的菜豆環氧水解酶突變體及構建方法

有效

• 申請號: 201810033898.0
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108048429B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;宗迅成;李闖;石小玲;袁風嬌;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/75;C12N1/21;C12N1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開一種立體選擇性提高的菜豆環氧水解酶突變體及構建方法，屬于酶工程技術領域。本發明通過菜豆來源的環氧水解酶進行單向定點突變，獲得對映選擇性與對映歸一性提高的突變酶W102L。W102L對外消旋間氯環氧苯乙烷(rac?mCSO)的最終ee_p，在25℃下從3.1％提高到81.7％。與野生型相比，W102L對外消旋對氯環氧苯乙烷rac?pCSO的E值從2.6提高至25.5，對rac?pCSO的對映選擇性提高了9.8倍。

技術領域

本發明涉及一種立體選擇性提高的菜豆環氧水解酶突變體及構建方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

對映純對氯環氧苯乙烷(pCSO)與其水解產物對氯苯乙二醇(pCPED)是多種手性藥物與功能材料的重要中間體，如R型對氯環氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗劑；R型對氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受體抑制劑——依利羅地的重要手性砌塊。目前，一系列合成對映純pCSO與pCPED的生物化學方法已經被報道。其中，Suresh等人利用一類手性大環席夫堿類化合物催化對氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其ee_p最高可達47％；Karboune等人利用來自重組黑曲霉(Aspergillus niger)的環氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋對氯環氧苯乙烷制備(R)-pCSO，當轉化率達到51％時，ee_s為87％并保留S型底物；Manoj等人使用兩種對映選擇性互補的EH(StEH與AnEH)協同水解外消旋pCSO合成(R)-pCPED，ee_p達到93％。利用EHs催化制備(R)-pCSO與(R)-pCPED與席夫堿催化合成相比，具有ee_p高，來源清潔，更易分離等優勢。

環氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能夠催化外消旋環氧化物的水解動力學拆分或對映歸一性水解，保留單一構型環氧化物或轉化為手性鄰二醇。該反應的立體化學結果與酶對底物的立體選擇性(包括對映選擇性與對映歸一性)緊密相關：具有對映選擇性的EHs快速催化某一構型環氧化物的水解反應，得到相應的產物鄰二醇以及保留另一構型環氧化物，即進行酶促動力學拆分。其中，EHs對外消旋環氧化物的對映選擇率E決定環氧化物的對映體純度。若繼續反應，另一構型環氧化物也會被水解，即進行酶促對映歸一性水解。底物完全轉化時，區域選擇性系數決定最終產物鄰二醇的對映體純度。環氧化物和鄰二醇的對映體純度通常用對映體過量值ee評價，分別表示為ee_s和ee_p。

EHs廣泛存在于各生物體中，如真菌、細菌、古生菌、病毒、植物和哺乳動物等。迄今為止，NCBI數據庫中收錄的EHs基因序列已達數千個。PDB數據庫中與EHs晶體結構相關的數據已達兩百多條，根據其晶體結構與催化機理的不同，EHs分為三類：(1)α/β水解折疊EHs，例如有微生物來源的ArEH，植物來源的StEH和動物來源的MmsEH；(2)非α/β水解折疊EHs，例如來源于人的LTA₄H；(3)其他類型，例如來源于紅串紅球菌的LEH。為了更好地將PvEH1應用于對映純的環氧化物與鄰二醇的工業生產，對現有的EHs中進行結構和特性方面的優化顯得十分必要。

發明內容

為了更好地將PvEH1應用于對映純的環氧化物與鄰二醇的工業生產，本發明利用定點突變獲得了立體選擇性提高的PvEH1突變體。本發明采用全質粒PCR的方法對102位色氨酸進行單向定點突變，獲得了立體選擇性和催化活性同時提高的突變酶W102L，解決了立體選擇性不能滿足生產高對映純環氧化物與鄰二醇的需求，為拓寬PvEH1的工業應用奠定了基礎。

本發明的第一個目的是提供一種環氧化物水解酶PvEH1的突變體，所述突變體含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本發明的第二個目的是提供編碼所述環氧化物水解酶突變體的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。