[發(fā)明專(zhuān)利]一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810033882.X
• 申請(qǐng)日: 2018-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108165538B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;闞婷婷;王婷婷;蘇永君;李劍芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/14;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P17/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開(kāi)了一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體，屬于基因工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。本發(fā)明的突變體是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基礎(chǔ)上，將第106位的纈氨酸突變成了異亮氨酸。本發(fā)明搖瓶誘導(dǎo)10h得到的突變酶PvEH1^V106I催化活性為234.75U/g，是野生型酶(157.15U/g)的1.49倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種催化活性提高的菜豆環(huán)氧化物水解酶突變體，屬于基因工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物等自然環(huán)境中，它能夠通過(guò)添加一分子水到環(huán)氧環(huán)上使得環(huán)氧化物開(kāi)環(huán)水解形成相應(yīng)的二醇，此過(guò)程無(wú)需輔因子以及金屬離子的參與。由于環(huán)氧化物水解酶在催化水解時(shí)具有高立體選擇性、反應(yīng)條件溫和及對(duì)環(huán)境污染小等特點(diǎn)，近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越重視它在生物催化水解外消旋環(huán)氧化物的應(yīng)用價(jià)值。

絕大多數(shù)的EHs按照催化機(jī)理的不同可分為三類(lèi)：一是檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物水解酶家族，代表為R.erythropLis EH(EC 3.3.2.8)；二是白三烯A₄水解酶；三是α/β-折疊環(huán)氧化物水解酶家族。目前研究最多的為α/β-折疊環(huán)氧化物水解酶家族。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的迅速發(fā)展，己有多種環(huán)氧化物水解酶的結(jié)構(gòu)得到解析，如：放射性土壤桿菌環(huán)氧化物水解酶Agrobacterium radiobacter AD1 EH(ArEH)，黑曲霉環(huán)氧化物水解酶Aspergillus nigerEH(AnEH)，人環(huán)氧化物水解酶Homo sapiens sEH(HssEH)，鼠環(huán)氧化物水解酶Mus msculusshe(MmsEH)，結(jié)核分枝桿菌環(huán)氧化物水解酶Mycobacterium tuberculosis EHA(MtEHA)，以及來(lái)自土豆環(huán)氧化物水解酶Solanum tuberosum EH(StEH)等。

α/β-折疊環(huán)氧化物水解酶家族的催化機(jī)制通常分為兩步：1)兩個(gè)酪氨酸殘基通過(guò)氨鍵接合環(huán)氧底物環(huán)氧乙烷上的氧原子，然后環(huán)氧化物水解酶上的天冬氨酸殘基親核攻擊環(huán)氧環(huán)上其中一個(gè)碳原子，形成二元醇－酯－酶共價(jià)結(jié)合的二聚體；2)一分子的水由于受到Asp/Glu-His殘基的活化產(chǎn)生一個(gè)烴基，從而攻擊之前形成的共價(jià)二聚體，釋放出鄰位二醇產(chǎn)物，親核試劑得重生。

雖然近年來(lái)環(huán)氧化物水解酶由于其反應(yīng)時(shí)無(wú)需輔因子或金屬離子的參與、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)在制備光學(xué)純的底物和產(chǎn)物上受到廣泛重視，但是在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用上，環(huán)氧化物水解酶因其酶活較低等缺陷限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。蛋白質(zhì)工程的優(yōu)勢(shì)在于能夠在一定程度上克服以上一系列的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個(gè)問(wèn)題是提供一種催化活性提高的環(huán)氧化物水解酶(PvEH1)突變體。

所述突變體是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白質(zhì)；

(b)在嚴(yán)格條件下與(a)限定的氨基酸序列雜交且編碼具有環(huán)氧化物水解酶活性的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述突變體的基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.3所示的序列。

本發(fā)明還提供獲得所述突變體的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上，將第106位的纈氨酸突變成了異亮氨酸(V106I)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以攜帶編碼環(huán)氧化物水解酶的基因PvEH1的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)并合成引物，通過(guò)PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到攜帶編碼突變體的基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主；培養(yǎng)宿主使之產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶突變體。