[發(fā)明專利]一種攜帶熒光Timer基因可變色的重組單純皰疹病毒及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810028164.3
• 申請日: 2018-01-11
• 公開（公告）號: CN110029127A
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王華東;徐富強;夏金金;蘇鵬;李穎利;林坤章
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;C12N7/01;G01N21/64;G01N1/28;G01N1/42;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發(fā)明公開了一種攜帶熒光Timer基因可變色的重組單純皰疹病毒及制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明制備的重組單純皰疹病毒在HSV跨多突觸環(huán)路示蹤中熒光Timer隨時間延長由綠色變?yōu)榧t色，為實時研究病毒跨突觸示蹤提供了時間維度上的重要考量，使得在不同時間感染病毒的神經(jīng)元可通過其熒光色彩差異而得以區(qū)分，從而間接獲得所標記神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與起始感染區(qū)域神經(jīng)元的連接級數(shù)。本發(fā)明成功獲得的攜帶熒光Timer基因可變色的重組單純皰疹病毒在時空維度上的神經(jīng)環(huán)路標記、病毒感染細胞過程、動物感染模型建立、病毒復(fù)制與致病機理的分析、抗病毒藥物篩選等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，一般涉及神經(jīng)生物學(xué)及病毒學(xué)，更具體涉及一種攜帶熒光Timer基因可變色重組單純皰疹病毒的構(gòu)建、制備，以及該重組單純皰疹病毒在時空維度上的神經(jīng)環(huán)路標記、動物感染模型建立、病毒復(fù)制與致病機理的分析、抗病毒藥物篩選等方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

大腦是人體最復(fù)雜的器官，研究神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)是理解大腦工作機制以及治療腦疾病的重要基礎(chǔ)，相應(yīng)就需要建立高效示蹤神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的示蹤工具及方法。傳統(tǒng)的化合物示蹤劑(如FluoroGold、PHAL等)只能標記局部神經(jīng)元的形態(tài)，不能跨突觸。近年來病毒示蹤工具逐漸廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路示蹤研究，此技術(shù)主要運用嗜神經(jīng)病毒能感染神經(jīng)元且復(fù)制的子代病毒能夠跨突觸感染相連神經(jīng)元的特性，另外病毒在每一個神經(jīng)元中能自我復(fù)制、信號不會衰減。

目前常用的嗜神經(jīng)病毒主要有來源于α皰疹病毒科的偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)和單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)以及棒狀病毒科的狂犬病毒(Rabies virus,RV)，其它還有水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)等，其中PRV Bartha株和RV是逆向跨突觸感染，VSV兩個方向都可以傳播。相對能特異順行跨突觸示蹤的是HSV-1H129株，H129是從一個腦炎患者腦部分離的毒株，在嚙齒類動物研究中H129是嚴格按順向跨突觸傳播的，和神經(jīng)沖動傳遞的方向一致，非常適合于標記輸出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。不過目前所有的跨多突觸工具病毒標記并不能區(qū)分病毒每跨一級突觸所需要的時間，為增加時間維度上的考量參數(shù)，我們設(shè)計將時間依賴可變色的熒光timer基因引入HSV工具病毒的構(gòu)建，建立可隨時間變色的單純皰疹病毒應(yīng)用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)示蹤。

自1962年在水母中發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(GFP)，和其它類似的熒光蛋白迅速發(fā)展成為高效的分子marker得到廣泛應(yīng)用。GFP是一種酸性蛋白，呈球柱狀結(jié)構(gòu)，形似圓桶的外殼保護中心區(qū)域的發(fā)光基團。GFP或其變體都有一個由三氨基酸組成的內(nèi)在發(fā)光基團。結(jié)構(gòu)上11條β桶狀結(jié)構(gòu)繞成一個圓柱體，一條α螺旋纏繞在圓柱體軸位置，生色團附在α螺旋上包埋于中心。生色團的光譜特性與它的包埋方式相關(guān)。2013年俄羅斯科學(xué)家Pletnev VZ等報道從脊索動物類文昌魚分離到一種新型紅色熒光蛋白(lancelet red fluorescentprotein，laRFP)具有一個新型的GYG發(fā)色團，并和臨近的酪氨酸殘基共價結(jié)合。lanRFP的激發(fā)光和發(fā)射光譜參數(shù)為λex/λem＝521/592nm，他們發(fā)現(xiàn)其更穩(wěn)定的突變體laRFP-ΔS83是一種很獨特的新型熒光Timer。文昌魚來源熒光蛋白和傳統(tǒng)的從刺胞動物如水母分離到的熒光蛋白在進化上相隔很遠，序列同源度僅20％左右。我們設(shè)計將該新型熒光Timer(laRFP-ΔS83)基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后構(gòu)建到順行跨突觸示蹤工具病毒HSV基因組，重組獲得時間依賴、可變色的新型HSV工具病毒，將在神經(jīng)環(huán)路解析、病毒感染細胞過程、動物感染模型建立、病毒復(fù)制動態(tài)分析、抗病毒藥物篩選等方面具有廣泛的應(yīng)用價值和前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種攜帶熒光Timer基因可變色的重組單純皰疹病毒，所述的重組單純皰疹病毒利用靶向載體重組制備得到，所述的靶向載體的序列為SEQ IDNO.3所示。

本發(fā)明的目的在于提供了一種攜帶熒光Timer基因可變色的重組單純皰疹病毒的構(gòu)建方法。