[發明專利]一種數字PCR芯片及其制備方法以及使用方法

在審

• 申請號: 201810027439.1
• 申請日: 2018-01-11
• 公開（公告）號: CN108373969A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 徐鐵剛;吳蕾;王雪鳳;李昕欣
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/00
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪;余永莉

本發明提供一種數字PCR芯片及其制備方法以及使用方法。該數字PCR芯片包括自下而上依次設置的：玻璃支撐層、密封層、反應層、空腔層以及防水層，其中，所述反應層與密封層通過鍵合在反應層與密封層之間形成主流道和通過主流道間隔開的多個獨立的PCR反應腔室，所述空腔層與反應層通過鍵合在空腔層與反應層之間形成空腔，所述反應層、空腔層以及防水層還具有依次貫穿的進樣口和出樣口，所述空腔層和防水層具有依次貫穿的空腔層入口和空腔層出口；其中，所述密封層、反應層和空腔層由聚二甲基硅氧烷制成，所述防水層由聚對二甲苯制成。根據本發明，提供了一種操作簡單的、速度快的、通量高的、自動化程度高的、造價低廉的數字PCR芯片。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，更具體地涉及一種數字PCR芯片及其制備方法以及使用方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。現已廣泛應用到基因檢測、基因擴增、基因工程等分子生物學領域，并且在臨床醫學、法醫學、親子鑒定以及環境檢測等方面發揮著不可替代的作用。然而PCR反應以指數級擴增，在幾十分鐘內即可擴增百萬倍，難于通過PCR產物確定原始PCR模板的含量。為了精確定量分析核酸含量，發明了數字PCR(digital PCR，dPCR)技術。dPCR的基本原理是將一個樣品等量稀釋成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含零個或一個拷貝的目標分子(初始DNA模板)，在每個反應單元中獨立進行單個拷貝DNA的PCR擴增，單獨反應單元中擴增出的DNA片段可以通過序列特異性探針分子發出的熒光顯示。擴增結束后，包含目標分子的反應單元有熒光信號記為陽性，沒有目標分子的反應單元則沒有熒光信號的記為陰性，通過陽性比例即可計算初始樣品中目標核酸模板的拷貝數。

dPCR技術主要分為兩大類型：液滴式dPCR(droplet-based dPCR，ddPCR)和微腔式dPCR(chamber-based dPCR，cdPCR)技術。ddPCR采用油包水的液滴進行PCR反應，具有高通量、高靈敏度的檢測優點，但一般需要液滴產生、收集、轉移等復雜的操作流程和配套儀器，其商品化的產品成本過高，儀器龐大操作復雜，不利于產品推廣和研究的普及。另外，所產生液滴的尺寸不穩定性還會影響檢測結果的準確性。相比較而言，cdPCR平臺上有固定大小的微腔存儲樣品液滴，使液滴大小相等，不會變化，確保了定量檢測結果的準確性，而且隨著技術的進步，微腔式PCR的通量也大為增高，能夠滿足一般需求。以微電子技術為基礎的微流控技術促進了dPCR技術發展，微流控芯片的微型化、集成化、試劑低消耗、操作簡便以及適用于現場檢測等優點使dPCR技術得到了更大的發展空間。聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)具有透明、生物兼容性好、價值低、易于制作等特性，被廣泛應用在dPCR上。

PDMS是高分子聚合物，能夠透過氣體并且能存儲一定量的空氣，因此在cdPCR上可以通過外加正壓將微腔內的氣體擠出，實現液體微腔終端填充，也可以通過將PDMS器件預先抽氣，依靠PDMS自身氣體存貯能力造成的負壓實現微腔終端填充。然而PDMS的氣體透過性帶來了一個嚴重問題，因為它會造成PCR過程中水分的揮發損失。水分揮發會影響PCR反應，微腔體系越小，這一現象越明顯。有研究者采用了在PCR反應微腔上方集成聚對二甲苯(Parylene)等材料的防水層，但是進樣必需的透氣需求和防止水分蒸發的不透氣需求形成矛盾，難以達到平衡，造成進樣慢以及水分低速揮發等問題。PDMS芯片的個體微腔體積必須足夠大才能彌補水分丟失帶來的影響，這樣就降低了cdPCR的通量。此外防水層是構建在PDMS層體中間，導致器件制備過程復雜。進樣以后整體防水是另外一種選擇，但增加了芯片使用操作的難度和時間，限制了臨場快速應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種數字PCR芯片及其制備方法以及使用方法，從而解決現有技術中的數字PCR芯片在必需的透氣需求和防止水分蒸發的不透氣需求二者之間難以達到平衡，造成進樣慢以及水分低速揮發的問題。