[發明專利]一種用于植物生長素分離純化的層析柱及分離方法

有效

• 申請號: 201810015432.8
• 申請日: 2018-01-08
• 公開（公告）號: CN108211425B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 肖浪濤;蘇益;藺萬煌;王若仲;羅為桂
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: B01D15/38
• 分類號: B01D15/38;C07D209/18;G01N30/02
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種用于植物生長素分離純化的層析柱及分離方法，層析柱內的樹脂中固定有IAA親和蛋白，如IAA7蛋白、TIR1受體蛋白和TIR1?IAA共受體蛋白等中的任意一種。本發明突破了傳統方法難以從微量植物樣品中有效分離和純化IAA的困難，解決了傳統方法操作復雜、有機抽提不環保和分離純化效率低的問題，大大提高IAA的分離純化效率，在植物鮮重為10～50mg情況下能從植物勻漿液中快速一步分離純化到足量的IAA用于液相?質譜聯用儀檢測。本發明中的分離純化方法大大簡化了IAA的分離純化過程、操作簡單并且成本低廉。

技術領域

本發明涉及一種用于分離純化植物生長素的層析柱及分離方法，尤其是涉及一種基于植物生長素親和蛋白的層析柱及分離方法。

背景技術

生長素(β-3-吲哚乙酸，簡稱IAA)是傳統五大類植物激素中最早被發現的一種，也是具有相當重要的生物學意義以及應用價值的一種植物生長物質。IAA普遍存在于植物體內，植物細胞一般利用色氨酸合成IAA，高濃度IAA抑制植物生長，低濃度促進植物生長，其對人和動物安全無害，亦無生理作用。目前，IAA的功能及其調控途徑的解析已經成為國內外的研究熱點，這些研究的前提就是要清楚IAA在植物不同部位的含量。然而，由于IAA在植物中的含量很低、遇光熱不穩定，導致了傳統的植物激素IAA的分離純化方法回收效率低，很難滿足微量和痕量植物樣品中IAA的定量分析的要求，并且傳統方法多采用有機抽提來分離純化IAA，步驟繁復且不環保，所以提供一種從微量和痕量植物樣品中高效分離純化IAA的新方法具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于植物生長素分離純化的層析柱及分離方法，解決了傳統方法操作步驟繁復、有機抽提不環保且回收效率偏低的問題，大大提高IAA分離純化效率。利用IAA親和蛋白具有與IAA結合能力強、特異性高的生物學特性，將其應用到IAA的分離層析純化中，利用生物識別系統而形成的一種新的IAA的分離純化方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種用于植物生長素分離純化的層析柱，層析柱內的樹脂中固定有植物生長素親和蛋白，層析柱的制備包括以下步驟：

1)將植物生長素親和蛋白注入到樹脂中，使親和蛋白與樹脂充分結合，清洗后得到固定有親和蛋白的樹脂；

2)將固定有植物生長素親和蛋白的樹脂注入到空的蛋白質純化重力柱中，靜置后即獲得層析柱。

進一步地，植物生長素親和蛋白選自IAA7蛋白、TIR1受體蛋白、TIR1-IAA共受體蛋白。

進一步地，TIR1-IAA共受體蛋白為TIR1-IAA7共受體蛋白。

進一步地，植物生長素親和蛋白上帶有蛋白標簽。

進一步地，蛋白標簽為GST標簽。

一種使用本發明中的層析柱分離純化植物生長素的方法，包括以下步驟：

1)將植物初提液注入層析柱，待生長素與植物生長素親和蛋白充分結合后從純化柱底部放出多余的液體，清洗柱床，酶切，收集柱床內溶液；

2)將收集的柱床內溶液濃縮干燥得到生長素與植物生長素親和蛋白的混合物，復溶混合物，離心后取上清即可得到生長素溶液。

進一步地，植物初提液的制備步驟為：液氮速凍后用研磨法充分粉碎植物樣品，加入緩沖液混勻，離心，上清即是植物初提液。

進一步地，復溶混合物使用的溶劑為乙腈水溶液。

進一步地，乙腈水溶液的質量分數為20％。

一種定量分析植物中生長素的方法，先使用本發明中的方法分離純化植物生長素。然后使用液相-質譜聯用儀檢測分析分離純化的植物生長素。

本發明的有益效果是：