[發(fā)明專利]基于代謝組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析篩選貝母生物堿合成關(guān)鍵基因的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810013175.4
• 申請(qǐng)日: 2018-01-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108103176A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)軍;陸續(xù);張琳寧;李萍;辛貴忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;G01N30/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于代謝組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析篩選貝母生物堿合成關(guān)鍵基因的方法。具體的是通過(guò)三種貝母的代謝組學(xué)分析得到差異性生物堿及其含量信息，同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)功能性注釋得到生物堿合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)情況。通過(guò)關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建差異代謝物?基因相關(guān)性關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，篩選出貝母中對(duì)生物堿含量貢獻(xiàn)度較大的生物堿合成途徑關(guān)鍵基因。本發(fā)明為進(jìn)一步闡明貝母中生物堿類物質(zhì)合成機(jī)制提供了重要信息，同時(shí)為通過(guò)基因調(diào)控等手段提高貝母生物堿含量提供了重要依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及貝母中生物堿合成途徑關(guān)鍵基因的篩選，具體的是結(jié)合三種貝母的代謝組學(xué)分析及生物堿合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出貝母中對(duì)生物堿含量貢獻(xiàn)度較大的生物堿合成途徑關(guān)鍵基因。

背景技術(shù)

貝母為百合科多年生草本植物，其鱗莖供藥用，廣泛分布于地中海、北美和中亞地區(qū)。土耳其、巴基斯坦和東南亞等地常用不同品種貝母作為傳統(tǒng)草藥。我國(guó)貝母屬植物資源豐富約有近50個(gè)種類，19個(gè)變種，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北和安徽等省，貝母屬植物的干燥鱗莖是常用的傳統(tǒng)中藥，主要用于清熱潤(rùn)肺，化痰止咳。由于產(chǎn)地、形態(tài)及藥效不同，常用藥用貝母主要有川貝母(Fritillariae cirrhosae bulbus)、浙貝母(Fritillariae thunbergii bulbus)和平貝母(Fritillariae ussuriensis bulbus)三個(gè)不同的品種。本研究所用川貝母為產(chǎn)自四川阿壩鎮(zhèn)的暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)。

貝母屬植物中的主要化學(xué)成分是生物堿類化合物，多數(shù)屬于甾體生物堿，其中以異甾生物堿為主，膽甾生物堿次之。甾體類生物堿包括貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、湖北甲素、西貝素和蒲貝酮堿等為貝母屬主要的生物活性成分。

近年來(lái)，針對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的基因調(diào)控已成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，而甾體生物堿類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，其含量和組成主要取決于生物合成關(guān)鍵基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。在植物細(xì)胞中，甾體生物堿類化合物主要來(lái)源于兩個(gè)前體物質(zhì)，異戊烯基焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑都能夠產(chǎn)生IPP和DMAPP，且兩條途徑所產(chǎn)生的IPP可以穿過(guò)質(zhì)體膜互為對(duì)方所用。IPP分子和兩個(gè)DMAPP分子在法尼基焦磷酸合酶(FPS)的作用下生成法尼基焦磷酸(FPP)，兩個(gè)FPP分子在鯊烯合酶(SQS)的作用下以頭-頭方式還原偶聯(lián)生成三萜類物質(zhì)的前體鯊烯。隨后，鯊烯在鯊烯環(huán)氧酶(SQE)的作用下氧化成2，3-氧化鯊烯，2，3-氧化鯊烯在環(huán)阿屯醇酶(CAS)作用下生成環(huán)阿屯醇，之后環(huán)阿屯醇在一系列酶的催化作用下生成甾體類化合物。有研究表明植物中也可能存在羊毛甾醇合酶(LAS)催化2，3-氧化鯊烯生成羊毛甾醇，羊毛甾醇經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到甾體類化合物。

本發(fā)明以探索貝母中差異代謝物含量和生物堿合成相關(guān)酶基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性為出發(fā)點(diǎn)，應(yīng)用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(UPLC-QQQ/MS)對(duì)三種貝母中的生物堿含量進(jìn)行了分析，同時(shí)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三種貝母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析找出與生物堿合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)情況，然后通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析構(gòu)建了貝母差異代謝物-基因表達(dá)關(guān)系圖，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了篩選。在本發(fā)明之前，尚未出現(xiàn)涉及基于貝母生物堿含量及其合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量對(duì)貝母生物堿合成關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建貝母差異代謝物含量和生物堿合成相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性關(guān)系，篩選不同貝母中對(duì)生物堿合成有重要作用的關(guān)鍵基因。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括下列步驟：

1)采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)三種貝母中生物堿類物質(zhì)進(jìn)行定性分析，再用UPLC-QQQ/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)定性得到的生物堿類物質(zhì)的進(jìn)行非靶標(biāo)定量分析。

2)高通量測(cè)序分析貝母中生物堿合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量。