[發(fā)明專利]circRAPGEF51在垂體腺瘤生物標(biāo)記中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810009207.3
• 申請日: 2018-01-04
• 公開（公告）號: CN107937546A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張波;王翔;婁佳成;李欣宇;呂逸竹;郝宇超
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京律遠專利代理事務(wù)所(普通合伙)11574
• 代理人: 丁清鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及circRAPGEF51(circRNA-RAPGEF5-1)在垂體腺瘤生物標(biāo)記中的應(yīng)用，具體為天然核糖核苷酸的用途技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

垂體腺瘤(簡稱垂體瘤)是人類最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的10％-15％。垂體瘤在組織學(xué)上屬于良性腫瘤，但有些垂體瘤呈侵襲性生長，包繞或侵犯周圍組織結(jié)構(gòu)，該部分腫瘤手術(shù)難以徹底切除，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一。根據(jù)垂體瘤的生物學(xué)行為可分為非侵襲性垂體瘤、侵襲性垂體瘤和垂體癌。侵襲性垂體瘤介于非侵襲性垂體瘤和垂體癌之間，其組織學(xué)形態(tài)屬于良性，生物學(xué)特征卻似惡性。侵襲性與非侵襲性垂體腺瘤的臨床表現(xiàn)、預(yù)后均明顯不同。侵襲性垂體腺瘤的壞死、卒中、囊變發(fā)生率明顯高于非侵襲性垂體腺瘤。侵襲性生長使得外科手術(shù)難以做到全切腫瘤，而常用藥物溴隱停、生長抑素對這類腫瘤的療效較差；侵襲性生長同樣限制了其對放療的敏感性，且鞍區(qū)放療容易導(dǎo)致正常垂體、下丘腦及視神經(jīng)等重要結(jié)構(gòu)的損傷。這些因素導(dǎo)致侵襲性垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高，腫瘤殘余組織增長快。顯而易見，對侵襲性垂體瘤的治療是神經(jīng)外科領(lǐng)域和腫瘤治療領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。因此，尋找與垂體腺瘤侵襲性相關(guān)的分子標(biāo)記對于及時治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。

環(huán)狀RNA是一類能夠閉合成環(huán)的長鏈非編碼RNA，在病毒、植物，古細菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量環(huán)狀RNA的存在。近年來，Norman E Sharpless等研究組通過高通量技術(shù)與生物信息學(xué)分析推測在哺乳類動物細胞中存在大量內(nèi)源性環(huán)狀RNAs，并通過Northern blot、二維凝膠電泳和反向引物PCR等生化實驗手段得到了證實。部分研究成果揭示了環(huán)狀RNAs可以通過消耗剪切小體、結(jié)合RNA聚合酶II以及吸附miRNA等方式，參與調(diào)控細胞生物行為中核心基因的表達。研究表明，環(huán)狀RNAs在多種腫瘤細胞中表達異常，提示其可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供circRAPGEF51(circRNA-RAPGEF5-1)在垂體腺瘤生物標(biāo)記中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：circRAPGEF51(circRNA-RAPGEF5-1)在垂體腺瘤生物標(biāo)記中的應(yīng)用，circRNA-RAPGEF5-1長449bp，位于人類的第7條染色體上22347957到22357656，RAPGEF5是該環(huán)狀RNA的覆蓋基因。

所述方法包括檢測來自所述對象的垂體腺瘤組織樣本中circRNA-RAPGEF5-1的量，其中較低量的circRNA-RAPGEF5-1為所述對象垂體腺瘤侵襲性強，并與所述對象預(yù)后不良可能性增加有關(guān)。

本發(fā)明還提供circRAPGEF51(circRNA-RAPGEF5-1)在垂體腺瘤生物標(biāo)記中表達，所述的表達方法包含以下步驟：

步驟一、侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織RNA提取；

步驟二、總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA；

步驟三、將cDNA進行定時定量PCR檢測，反應(yīng)結(jié)束后檢測樣品中circRNA-RAPGEF5-1的PCR識別序列，然后與PCR產(chǎn)物序列結(jié)果進行對比可知circRNA-RAPGEF5-1在垂體腺瘤組織中進行表達。

進一步優(yōu)選，所述的步驟一中侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織RNA提取方法是相同的，具體提取方法為：稱取2克組織材料，加入250微升RNAiso Plus，手持電動器研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5毫升RNase-free的離心管中，12000轉(zhuǎn)4℃離心10分鐘，去上清200微升加入1.5毫升RNase-free的離心管中，加入1毫升RNAiso Plus新混勻后室溫靜置5分鐘，加入200微升的氯仿，充分混勻后，室溫靜置3分鐘，12000轉(zhuǎn)4℃離心15分鐘，取上清250ul，加入500微升異丙醇混勻后室溫靜置10分鐘，12000轉(zhuǎn)4℃離心10分鐘。棄掉上清，加入75％乙醇，顛倒混勻后，7500轉(zhuǎn)4℃離心5分鐘，棄掉上清，室溫靜置5分鐘，加入15-20微升Nuclease-Free water溶解。Nanodrop測算所得液體的OD值及濃度。