[發明專利]一種檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法

在審

• 申請號: 201810001075.X
• 申請日: 2018-01-02
• 公開（公告）號: CN109988859A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 宋薇;張斌;崔山
• 申請（專利權）人: 青島譜尼測試有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征為，實時熒光PCR檢測草貝母和輪葉貝母成分的引物探針，分別為：

實時熒光PCR檢測草貝母源性成分的引物探針，分別為：上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG，下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG，帶有熒光染料的探針序列為：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA

實時熒光PCR檢測輪葉貝母成分的引物探針，分別為：上游引物P1：CTACTCGGGACCTCGCAAT，下游引物P2：CACCGCAGAGGCATCGAC，帶有熒光染料的探針序列為：TCCTCGGACACTATTT。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征在于：檢測草貝母成分探針的熒光染料為：5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記；檢測輪葉貝母成分探針的熒光染料為：5‘端為VIC標記，3’端為MGB標記。

3.根據權利要求1所述的一種快速檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征在于如下步驟：

1)提取待檢樣品基因組DNA；

2)以所提取的DNA作為模板，加入權利要求1所述的引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應，記錄樣品反應的Ct值。

4.根據權利要求3所述的一種快速檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征在于：將檢測草貝母和輪葉貝母的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L，然后等體積合并為混合引物(探針)，所述的實時熒光PCR反應體系為：

5.根據權利要求4所述的一種快速檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征在于：所述的實時熒光PCR反應條件為95℃ 10min，1個循環95℃ 15s，58℃ 30s，40個循環。

6.根據權利要求3、4和5所述的一種快速檢測草貝母和輪葉貝母成分的方法，其特征在于：所述的實時熒光PCR方法還設有空白對照、陰性對照、陽性對照，判定標準為：

空白對照：以ddH₂O為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40；

陰性對照：以非草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40；

陽性對照：以含有草貝母和輪葉貝母基因組DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，FAM和VIC通道檢測Ct值大于或等于40檢測Ct值小于或等于36；

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值大于或等于40，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分；

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值小于或等于36，陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常者，判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分；

待測樣品FAM和(或)VIC通道檢測Ct值在36-40之間，重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后結果Ct值大于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品未檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分；再次擴增后結果Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結果正常，判定該樣品檢出草貝母和(或)輪葉貝母成分。