[發(fā)明專利]用于環(huán)狀共有序列測序的單鏈環(huán)狀DNA文庫

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780078583.1
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN110062809B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設計）人: T.蓋圖什;R.陳;A.理查森
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6855
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;黃希貴

本發(fā)明是一種通過利用環(huán)狀捕獲分子生成環(huán)狀單鏈核酸分子的文庫的新型方法。該方法不受靶核酸分子大小限制，并且可以潛在地容納非常長的分子。該方法可應用于核酸測序，例如納米孔測序，其中可讀取無限長度的模板。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及核酸測序的領域。更具體地，本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于單分子測序的環(huán)狀模板DNA的文庫的領域。

發(fā)明背景

當前一代的核酸測序方法利用靶分子的文庫，由此對每個單獨分子進行測序。文庫中的每個分子包含待分析的靶序列，其與選擇的測序方法和測序儀器所必需的人工序列(“銜接子”)綴合。通常對雙鏈DNA?(dsDNA)分子進行單分子測序，所述雙鏈DNA在兩側具有相同的銜接子。通常，對這些分子進行測序，在一次讀取中產(chǎn)生來自每個分子的有義鏈和反義鏈兩者的數(shù)據(jù)。為了僅從一條鏈產(chǎn)生測序文庫，可以使用用銜接子或夾板環(huán)化靶分子。然而，生成環(huán)狀單鏈文庫的現(xiàn)有方法是低效的并且受原始靶分子的大小限制。無論原始分子大小如何，本文描述的方法都能夠有效地生成單鏈環(huán)狀核酸分子的文庫。

發(fā)明概述

在一些實施方案中，本發(fā)明是從包含多種雙鏈靶核酸分子的樣品制備環(huán)狀單鏈靶核酸分子的文庫的方法，所述方法包括：將銜接子連接至雙鏈靶分子的每個末端，由此形成銜接子-連接的雙鏈分子；使所述銜接子-連接的雙鏈分子變性，由此形成銜接子-連接的分子的兩條鏈；使捕獲分子退火至所述銜接子-連接的分子的每條鏈，由此形成包含與在所述銜接子-連接的分子的鏈的5'-末端和3'-末端的銜接子序列雜交的捕獲分子的雜合分子，其中所述捕獲分子是環(huán)狀單鏈核酸分子，其包含與所述銜接子的至少一部分互補的兩個序列；延伸銜接子-連接的分子的鏈的3'-末端，以到達銜接子-連接的分子的鏈的5'-末端；連接銜接子-連接的分子的鏈的5'-末端和3'-末端，由此形成包含捕獲分子和銜接子-連接的分子的環(huán)化鏈的雜合分子；和將所述捕獲分子與銜接子-連接的分子的環(huán)化鏈分離，由此形成環(huán)狀單鏈靶核酸分子的文庫。

在一些實施方案中，所述銜接子包含至少一個雙鏈區(qū)域和至少一個單鏈區(qū)域，其各自包含兩條鏈。在一些實施方案中，所述銜接子包含至少一個條形碼和至少一個引物結合位點。在一些實施方案中，所述捕獲分子包含與所述銜接子的單鏈區(qū)域的至少一部分互補的兩個序列。在一些實施方案中，所述捕獲分子包含與所述銜接子的單鏈區(qū)域和雙鏈區(qū)域互補的兩個序列。在一些實施方案中，所述條形碼是多重樣品識別條形碼(MID)或獨特分子識別條形碼(UID)。在一些實施方案中，所述引物是測序引物。在一些實施方案中，與所述銜接子的至少一部分互補的序列在所述捕獲分子中彼此直徑上相對的位置。

在一些實施方案中，所述捕獲分子包含條形碼、引物結合位點和用于被固體支持物捕獲的結合部分中的一種或多種或全部。在一些實施方案中，所述捕獲分子是生物素化的。在一些實施方案中，所述捕獲分子在結合所述靶分子期間固定化在固體支持物、諸如鏈霉抗生物素蛋白包被的珠粒或表面上。

在一些實施方案中，本發(fā)明是對包含多種靶分子的樣品中的靶核酸進行測序的方法，所述方法包括：使用上述方法從所述樣品產(chǎn)生環(huán)狀靶核酸分子的文庫，其中所述銜接子進一步包含測序引物的結合位點；使所述測序引物退火至所述結合位點；和延伸所述測序引物，由此獲得所述靶核酸的序列。在一些實施方案中，所述測序引物通過DNA聚合酶、諸如Phi29聚合酶延伸。在一些實施方案中，通過測量在引物延伸期間標記的核苷酸的并入來獲得序列。在一些實施方案中，通過基于納米孔的方法獲得序列。