[發明專利]用作疫苗的表達外泌體錨定蛋白的核苷酸序列

在審

• 申請號: 201780076288.2
• 申請日: 2017-10-11
• 公開（公告）號: CN110049775A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: M·P·M·費德里科
• 申請（專利權）人: 國家高等衛生院
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;徐志明

本發明涉及用作疫苗的表達融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表達載體，所述融合蛋白包含在C?末端與抗原融合的外泌體錨定蛋白、或由其組成。

技術領域

本發明涉及用作疫苗的表達外泌體(exosome)錨定蛋白的核苷酸序列。特別地，本發明涉及用作疫苗的表達融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表達載體，所述融合蛋白包含在C-末端與抗原融合的外泌體錨定蛋白、或由其組成。

背景技術

已知免疫反應可以提供對外部和內部健康威脅的保護。在許多情況下，當天然免疫不能抑制病理的發展時，通過接種免疫原引起的免疫反應可以阻斷病理過程，例如通過誘導針對幾種感染性病原體的中和抗體來進行。

不同的是，基于CTL的疫苗的鑒定、生產和銷售受到更多限制，盡管普遍認為其對于對抗慢性感染和腫瘤疾病的發展具有潛在的用途。

引發強烈和廣泛的CTL免疫反應預期對于幾種病癥的治療具有治療意義。例如，幾個證據表明，細胞介導的免疫反應在控制HPV感染并且因此在控制病毒相關的瘤形成中起著重要作用。事實上，無論是一般的免疫抑制還是不良的抗HPV CTL反應，都與病毒持續性和疾病進展相關。

用于誘導抗原特異性CTL免疫的最常用的實驗技術是基于病毒載體、肽和滅活病原體的使用。然而，迄今為止，市場上還沒有CTL免疫原性藥物。

用于產生免疫原性蛋白的DNA疫苗接種認為是成功的。例如，一種針對日本腦炎的DNA疫苗已于2010年發布供人類使用(1)。此外，已批準用于保護馬免于西尼羅河病毒影響的獸用DNA疫苗(2，3)。此外，據報道，針對多發性硬化的DNA疫苗接種的初步研究是有效的(4)。總而言之，這些證據支持這樣的觀點，即原則上，DNA疫苗接種可以具有在人類中應用的前景。在DNA疫苗接種的優點中，應該提到的是研發和生產的簡易性、儲存穩定性、成本效益和免疫原的持久性。理論上的缺點表現為可能產生抗DNA抗體，以及對細胞生長的遺傳控制的機制的干擾。然而，主要的限制表現為誘發免疫反應的效力不足。出于這個原因，許多疫苗接種方案(包括為了引發免疫反應使用DNA)繼之在替代配方的免疫原接種以增強免疫。

外泌體是所有細胞類型組成性地釋放的50-100納米的囊泡。它們由內體膜的向內內陷產生。這些管腔內的囊泡形成可以運輸至質膜的多泡體(VB)，它們與質膜融合，從而釋放它們的囊泡內容物至胞外環境中。已經在肌細胞中描述了顯示出類似于外泌體的物理和生物化學特征，但是通過質膜的直接擠出產生的納米囊泡(5，6)。盡管之前認為外泌體專門用于分泌廢細胞材料，但現在已經認識到外泌體是細胞間通信網絡的部分。它們包括了可在靶細胞中起作用的信使RNA、微RNA、DNA和蛋白質。

它們的免疫原性基本上是它們并入的抗原的數量和質量的結果。外泌體作為抗腫瘤免疫刺激劑進行了研究，并且在一些情況下它們獲得了臨床試驗的批準(7-9)。自發地上載腫瘤抗原(主要是跨膜蛋白，如gp100、TRP-1、Her2/neu和CEA)的外泌體已經發現誘導特異性抗腫瘤T細胞免疫的激活(10，11)。臨床試驗證明了外泌體在腫瘤患者中作為無細胞疫苗的可行性和良好耐受性。然而，它們的治療效果似乎非常有限，因此需要新的方法來提高其免疫原性。這個問題通過工程化外來抗原以增加它們在外泌體膜上的展示來解決。在這個方面，到目前為止已經描述了兩種策略。第一種策略是利用乳粘素的C1C2結構域與外泌體脂質的結合，導致異源抗原與外泌體膜的外側結合。另一種策略依賴于用具有高度疏水的跨膜結構域尾的金黃色葡萄球菌腸毒素A包被外泌體為。