[發(fā)明專利]一種空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611116336.X
• 申請(qǐng)日: 2016-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN106590630B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于曉強(qiáng);李學(xué)晨;孫渝明;田明剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/06
• 分類號(hào): C09K11/06;C07D401/14;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發(fā)明公開了一種空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針，該探針是式(I)所示結(jié)構(gòu)的吡啶鹽類化合物，試驗(yàn)顯示本發(fā)明的探針夠在線粒體膜電位正常的細(xì)胞內(nèi)高選擇性標(biāo)記內(nèi)線粒體；在線粒體膜電位降低的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)標(biāo)記線粒體和細(xì)胞核，并且膜電位降低程度越大細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度越高；最終當(dāng)線粒體膜電位完全消失后探針全部靶向到細(xì)胞核上。另外該探針還能夠同時(shí)區(qū)分死活細(xì)胞，顯著優(yōu)于目前使用的雙染料相關(guān)產(chǎn)品，預(yù)示本發(fā)明的探針在生物研究和醫(yī)療診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種線粒體膜電位熒光探針及其應(yīng)用，尤其涉及一種空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針及其在熒光成像顯示不同狀態(tài)的線粒體膜電位或在同時(shí)檢測(cè)、顯示或區(qū)分死活細(xì)胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

線粒體膜電位(MMP)是表示線粒體功能的重要參數(shù)，它的降低預(yù)示著線粒體呼吸鏈的損壞從而導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂甚至死亡。因此，來自不同狀態(tài)MMP的反饋對(duì)于生物研究以及相關(guān)疾病的診斷是非常重要的。通常來講，健康細(xì)胞的MMP是正常的；處于降低狀態(tài)的MMP預(yù)示著某些功能性紊亂，例如，精子MMP的降低表明精子活性下降；處于消失狀態(tài)的MMP表明細(xì)胞進(jìn)入疾病狀態(tài)，比如，MMP消失的瘧疾蟲表明其應(yīng)經(jīng)被青蒿素殺死了。因此，開發(fā)一種新的探針去方便有效地檢測(cè)MMP的不同狀態(tài)在生物和醫(yī)學(xué)研究中是非常有意義的。

到目前為止，檢測(cè)MMP的探針可以分為兩類：1)熒光強(qiáng)度探針，主要代表有帶有聚集淬滅效應(yīng)的羅丹明123、TMRE和TMRM。它們可以聚集在帶有正常MMP的線粒體上并且由于高濃度產(chǎn)生的淬滅效應(yīng)發(fā)出較弱的熒光。當(dāng)MMP降低時(shí)，部分的探針釋放到胞質(zhì)中，其余的仍然存留在線粒體上，此時(shí)這些探針的濃度降低發(fā)出較強(qiáng)的熒光。當(dāng)MMP消失后，所有的探針都釋放達(dá)到胞質(zhì)中去，并且仍然是處于低濃度的探針發(fā)出與降低狀態(tài)相似的熒光。因此，這就很難通過熒光照片來區(qū)分降低狀態(tài)的MMP和消失狀態(tài)的MMP。2)雙色熒光探針，主要代表是JC-1。在MMP高的時(shí)候它處于聚集態(tài)并且發(fā)射出紅色的熒光，在MMP低的時(shí)候它處于單體態(tài)并且發(fā)射出綠色的熒光。因此可以通過比較顏色變化用來判斷MMP的高低。然而，當(dāng)染色濃度稍低時(shí)，所述雙色熒光探針就很難形成聚集體，當(dāng)染色濃度稍高時(shí)，又因其很差的水溶性會(huì)形成塊狀沉淀阻礙觀察。因此在每次實(shí)驗(yàn)之前都要進(jìn)行反復(fù)地濃度調(diào)試，這無疑給實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)帶來的很大的不便。基于此，開發(fā)一種方便有效的空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針來檢測(cè)不同狀態(tài)的MMP或利用其同時(shí)檢測(cè)或顯示死活細(xì)胞具有重要意義，也是目前迫切需要解決的科研課題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針，其特征在于：所述熒光探針是式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物：

式(I)所示化合物的化學(xué)名稱為1-丁烷基-4-((E)-2-(9(2-乙氧基乙基)-6-((E)-2-(吡啶-4-)乙烯基)-9-咔唑-3)-乙烯基)-吡啶碘鹽。簡(jiǎn)稱：LAD。

上述式(I)所示化合物(LAD)的制備方法概述如下：

在干燥的三口瓶中加入9-(2-乙氧基乙基)-3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶基)-咔唑，甲醇，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，升溫至55℃，加熱30min后全部溶解，加入0.168g化合物6(N-丁烷基-4-甲基吡啶碘鹽)，滴加哌啶6滴，升溫至回流，過夜，停止加熱，冷卻后蒸干溶劑，用甲醇重結(jié)晶，干燥，得到的深紅色粉末即為L(zhǎng)AD。

上述式(I)所示化合物(LAD)制備反應(yīng)式如下：

本發(fā)明所述空間依賴型的線粒體膜電位熒光探針在標(biāo)記或顯示線粒體在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

其中：所述活細(xì)胞為永生化細(xì)胞或正常細(xì)胞。進(jìn)一步的：所述永生化細(xì)胞優(yōu)選為HeLa或SiHa細(xì)胞，所述正常細(xì)胞優(yōu)選為HUVEC細(xì)胞。