[發明專利]用于海藻宿主細胞的CRISPR-Cas系統

在審

• 申請號: 201780055558.1
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN109689856A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: J·C·利普梅爾;Y·貝茨;J·A·柔布斯;R·沃瓦爾
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12N15/11;C12N15/79
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種非天然存在的或工程化的組合物，其包含CRISPR-Cas系統的來源，所述CRISPR-Cas系統包含引導多核苷酸和Cas蛋白，其中所述引導多核苷酸包含引導序列，所述引導序列基本上為宿主細胞中靶多核苷酸的反向互補物，且所述引導多核苷酸可指導Cas蛋白在所述宿主細胞中靶多核苷酸處的結合以形成CRISPR-Cas復合物，其中所述引導序列基本上是所述宿主細胞的基因組中的5′-(N)yPAM-3′多核苷酸序列靶物的(N)y部分的反向互補物，其中y是8-30的整數，其中PAM是前間區序列鄰近基序，其中所述宿主細胞是網粘菌綱(Labyrinthulomycete)，優選破囊壺菌目(Thraustochytriales)的成員，優選破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)成員，更優選選自下組的菌屬的成員：Aurantiochytrium、Oblongichytrium、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)和吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)，甚至更優選裂殖壺菌屬菌種ATCC#20888，且其中PAM優選為選自下列的序列：5′-XGG-3′、5′-XGGXG-3′、5′-XXAGAAW-3′、5′-XXXXGATT-3′、5′-XXAGAA-3′、5′-XAAAAC-3′，其中X可為任何核苷酸或其類似物，優選地，X可為任何核苷酸；且W是A或T。

2.根據權利要求1的組合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸編碼和/或所述引導多核苷酸由多核苷酸編碼或存在于多核苷酸上。

3.根據權利要求1或2的組合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸編碼和/或所述引導多核苷酸由另一個多核苷酸編碼或存在于另一個多核苷酸上，且所述多核苷酸包含在載體中。

4.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述引導多核苷酸由多核苷酸編碼，所述多核苷酸被轉錄以提供實際的引導多核苷酸。

5.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸編碼，且所述引導多核苷酸由另一個多核苷酸編碼或存在于另一個多核苷酸上且所述多核苷酸包含在一個載體中。

6.根據權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述Cas蛋白由包含在載體中的多核苷酸編碼，且所述引導多核苷酸由包含在另一個載體中的另一個多核苷酸編碼，或存在于包含在另一個載體中的另一個多核苷酸上，其中，優選地，編碼所述Cas蛋白的載體由低強度啟動子驅動，且編碼所述引導多核苷酸的載體由高強度啟動子驅動。

7.根據權利要求6的組合物，其中一個或多個或全部載體包含選擇性標記，優選每個載體包含不同的選擇性標記。

8.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中一個或多個外源多核苷酸可操作地連接至所述引導多核苷酸。

9.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述Cas蛋白包含至少一個核定位序列，優選異源核定位序列。

10.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述Cas蛋白具有在所述靶序列的位點處直接剪切兩個多核苷酸鏈的活性。

11.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述Cas蛋白編碼多核苷酸是針對所述宿主細胞密碼子優化的，優選密碼子對優化。

12.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述引導多核苷酸由多核苷酸編碼，所述多核苷酸可操作連接至RNA聚合酶II或III啟動子，優選連接至網粘菌綱EF-1啟動子。

13.根據權利要求1-12中任一項的組合物，其中可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子的多核苷酸編碼包含所述引導多核苷酸和自處理核酶的前引導多核苷酸，其中，當轉錄時，所述引導多核苷酸通過自處理核酶從前引導多核苷酸轉錄物中釋放。