[發明專利]用于純化雙鏈核酸的方法和組合物

在審

• 申請號: 201780055280.8
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN109661467A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: P.貝拉雷;C.霍爾庫姆;A.卡西拉;T.赫里斯;Q.阮;K.坎帕尼;I.科茨洛夫
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;楊思捷

本文提供了在磁性玻璃顆粒上有效地分離短雙鏈核酸的方法和組合物。

發明背景

磁性玻璃珠粒方便地用于核酸純化。最近，已經聚焦于從以微創或非侵入性方式(例如從血液、唾液、尿液等)獲得的樣品中獲得核酸。這些樣品中的無細胞核酸(cfNAs)可以包括相對短的多核苷酸，例如，小于100或1000 bp，所述多核苷酸不能使用標準結合和洗脫條件用磁性玻璃珠粒有效地回收。此外，使用標準條件獲得的雙鏈cfNA（其對于一些分析技術是必需的）不足。

發明概述

本文提供了用于從磁性玻璃珠粒(MGP)自動回收雙鏈核酸的方法和組合物。所述方法包括使用兩次或更多次低溫洗脫來從MGP洗脫與MGP非共價結合的雙鏈核酸。在一些實施方案中，所述方法包括a)將磁場施加至盛放溶液(例如，包含洗滌緩沖液或具有結合緩沖液的樣品)中的與MGP非共價結合的雙鏈核酸的容器，并去除未與MGP結合的液體；b)在低于70℃(例如，25-60℃、25-50℃、30-45℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、60℃、65℃)的溫度下在容器中使與MGP非共價結合的雙鏈核酸與洗脫緩沖液接觸；c)將磁場施加至容器；d)收集未與MGP結合的液體，由此收集洗脫物；e)在低于50℃的溫度下在容器中使與MGP非共價結合的雙鏈核酸與洗脫緩沖液接觸；f)將磁場施加至容器；和g)收集未與MGP結合的液體，由此收集洗脫物；其中步驟d)和g)中收集的洗脫物包含從MGP回收的雙鏈核酸。

步驟b)和e)中的溫度低于50℃，特別是25℃至45℃，例如25℃、37℃、42℃或45℃。在一些實施方案中，所述雙鏈核酸長度為30-1500或50-500個堿基對。在一些實施方案中，所述雙鏈核酸來自無細胞樣品，例如選自血液、血漿、血清、羊水、腦脊液和尿液。在一些實施方案中，所述雙鏈核酸來自無細胞核酸。在一些實施方案中，所述雙鏈核酸來自細胞來源，例如來自細菌、其他病原體或組織的基因組DNA。在一些實施方案中，所述雙鏈核酸長度為1000或更多個堿基對，例如5000或更多個堿基對。

在一些實施方案中，步驟a)中的溶液具有低于7(例如，3-6.5或3.5-6)的pH。在一些實施方案中，所述洗脫緩沖液具有大于7(例如，7-10或7.5-9)的pH。

在一些實施方案中，自動化方法在步驟a)之前進一步包括：在容器中使含有雙鏈核酸的液體樣品與MGP接觸，由此在容器中允許雙鏈核酸非共價結合溶液(例如，有或沒有結合緩沖液)中的MGP；將磁場施加至容器并去除未與MGP結合的液體，由此留下與MGP非共價結合的雙鏈核酸；和將液體(例如，洗滌緩沖液)添加至與MGP非共價結合的雙鏈核酸。在一些實施方案中，將與MGP非共價結合的雙鏈核酸懸浮于洗滌緩沖液中、施加磁場和去除未結合的液體的步驟在洗脫之前實施多于一次(例如，2、3、4或5次)。

在一些實施方案中，在步驟b)和e)中使洗脫緩沖液和與MGP非共價結合的雙鏈核酸接觸至少5分鐘(例如，5-10、10-30、5-25或7-25分鐘)。在一些實施方案中，洗脫(與洗脫緩沖液接觸)較短，但實施更多次洗脫，例如3-5次洗脫，且持續時間少于5分鐘。在一些實施方案中，實施多于兩次洗脫，例如3、4、5或6次洗脫。在一些實施方案中，兩次或更多次洗脫具有不同的持續時間，而在其他實施方案中，所述洗脫具有相同的持續時間。

在一些實施方案中，使用自動化移液器將洗脫緩沖液和與MGP非共價結合的雙鏈核酸混合。在一些實施方案中，所述容器是多孔板中的孔。在一些實施方案中，所述容器是管，例如容量為1-5或1.5-3 mL。在一些實施方案中，所述容器是芯片中的微孔/微室。

在一些實施方案中，在來自步驟d)和g)的洗脫物中回收的核酸包含至少30%雙鏈核酸(例如，非變性的，天然配對的)。也就是說，在洗脫物中回收的雙鏈核酸占洗脫物中總核酸的至少30%。在一些實施方案中，在來自步驟d)和g)的洗脫物中回收的核酸包含至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或更多雙鏈核酸。

發明詳述

I. 引言