[發(fā)明專利]多重優(yōu)化錯配擴(kuò)增(MOMA)靶標(biāo)數(shù)目

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780040673.1
• 申請日: 2017-04-29
• 公開（公告）號: CN109661475A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 青·富田·米切爾;卡爾·施塔姆
• 申請（專利權(quán)）人: 威斯康星州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬

本發(fā)明涉及用于評估例如來自對象的樣品中非天然核酸的量的方法和組合物。本文中提供的方法和組合物可用于確定對象中病癥的風(fēng)險。

相關(guān)申請

本申請依據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2016年4月29日提交的美國臨時申請62/330,053的申請日權(quán)益，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于評估來自對象的樣品中非天然核酸的量的方法和組合物。本文中提供的方法和組合物可用于確定病癥例如移植排斥或胎兒的不利病癥的風(fēng)險。本發(fā)明還涉及用于使用多重優(yōu)化錯配擴(kuò)增(multiplexed optimized mismatch amplification，MOMA)用于評估非天然無細(xì)胞脫氧核糖核酸(非天然無細(xì)胞DNA，例如供體特異性無細(xì)胞DNA)的量的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容

本公開內(nèi)容至少部分地基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：可使用多重優(yōu)化錯配擴(kuò)增(MOMA)來量化來自對象的樣品中的低頻率非天然核酸。多重優(yōu)化錯配擴(kuò)增涵蓋這樣的引物設(shè)計，所述引物可包含用于擴(kuò)增特定序列的3’倒數(shù)第二位錯配，和相對于另一序列的雙錯配。用這樣的引物進(jìn)行擴(kuò)增可允許定量地確定樣品中非天然核酸的量，甚至在非天然核酸的量在異質(zhì)核酸群中為例如1％或甚至0.5％以下的情況下也如此。

本文中提供了與這樣優(yōu)化的擴(kuò)增相關(guān)的方法、組合物和試劑盒。所述方法、組合物或試劑盒可以是本文中分別提供的任一種方法、組合物或試劑盒，包括實(shí)例和附圖中的那些中的任一種。

令人驚訝的是，如果來自對象的樣品中的非天然核酸來自外源，例如另一個對象，例如供體或胎兒，則可以使用少至6種信息性靶標(biāo)(informative target)來確定樣品中非核酸的量。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中提供的任一種方法、組合物或試劑盒與至少6種信息性SNV靶標(biāo)相關(guān)。因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了“通用”靶標(biāo)組(即，基于群體內(nèi)SNV信息并且不考慮天然或非天然核酸的基因型或與疾病或病癥相關(guān)的特定突變而設(shè)計的靶標(biāo)組)，需要至少約18種SNV靶標(biāo)才能得到6種信息性靶標(biāo)。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中提供的任一種方法、組合物或試劑盒與至少18種SNV靶標(biāo)有關(guān)。

在一個方面，提供了一種評估來自對象的樣品中非天然核酸的量的方法，所述樣品包含非天然和天然核酸。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括針對至少6種單核苷酸變體(single nucleotide variant，SNV)信息性靶標(biāo)中的每一種，用至少兩種引物對對樣品或其部分進(jìn)行基于擴(kuò)增的定量測定，其中每種引物對包含正向引物和反向引物，其中所述至少兩種引物對中的一種在引物中包含相對于SNV靶標(biāo)之一種等位基因的3’倒數(shù)第二位錯配，然而包含相對于SNV靶標(biāo)之另一種等位基因的3’雙錯配，并且特異性地擴(kuò)增SNV靶標(biāo)之所述一種等位基因，并且所述至少兩種引物對中的另一種特異性地擴(kuò)增SNV靶標(biāo)之所述另一種等位基因，以及獲得或提供來自基于擴(kuò)增的定量測定的結(jié)果以確定樣品中非天然核酸的量。

在一個實(shí)施方案中，結(jié)果在報告中提供。

在本文中提供的任一種方法的一個實(shí)施方案中，所述方法還包括基于所述結(jié)果確定樣品中非天然核酸的量。在本文中提供的任一種方法的一個實(shí)施方案中，所述結(jié)果包含樣品中非天然核酸的量。

在本文中提供的任一種方法的一個實(shí)施方案中，所述方法包括獲得來自對所述樣品或其部分進(jìn)行的基于擴(kuò)增的定量測定的結(jié)果，其中所述測定包括對于至少6種單核苷酸變體(SNV)信息性靶標(biāo)中的每一種用至少2種引物對擴(kuò)增該信息性靶標(biāo)，其中每種引物對包含正向引物和反向引物，其中所述至少兩種引物對中的一種在引物中包含相對于所述SNV靶標(biāo)之一種等位基因的3’倒數(shù)第二位錯配，然而包含相對于所述SNV靶標(biāo)之另一種等位基因的3’雙錯配，并且特異性地擴(kuò)增所述SNV靶標(biāo)之所述一種等位基因，并且所述至少兩種引物對中的另一種特異性地擴(kuò)增所述SNV靶標(biāo)之所述另一種等位基因，以及基于所述結(jié)果評估非天然核酸的量。

在本文中提供的任一種方法的一個實(shí)施方案中，樣品中非天然核酸的量基于所述基于擴(kuò)增的定量測定的結(jié)果。