[發明專利]具有降低的背景的基于光學的納米孔分析

有效

• 申請號: 201780006777.0
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN108463560B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 丹尼爾·科斯洛夫;布雷特·N·安德森
• 申請（專利權）人: 昆塔波爾公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G01N21/64;G01N33/487
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李平;鄭霞

本發明涉及包含不透明層的納米孔陣列，所述不透明層降低在應用此類陣列用于分析分子中收集的光學信號中的背景熒光。在一些實施方案中，此類陣列用于在包括以下步驟的方法中確定聚合物諸如多核苷酸的特征：使聚合物易位穿過所述陣列的納米孔，其中聚合物具有一個或更多個光學標記物，激發從所述不透明層向激發光束的方向延伸的每個納米孔的信號生成區中的聚合物的光學標記物，檢測來自每個納米孔的信號生成區的光學信號以確定穿過其易位的聚合物的特征。

本申請要求2016年1月15日遞交的美國臨時專利申請第62/279,503號和2016年3月14日遞交的美國臨時專利申請第62/308,145號的優先權權益，其各自通過引用整體并入本文。

背景

過去十年發展的DNA測序技術已經改變了生物科學，例如van Dijk等,Trends inGenetics,30(9):418-426(2014)。然而，要實現技術的全部潛力，仍必須克服一系列挑戰，包括降低每次運行測序成本、簡化樣品制備、縮短運行時間、增加序列讀段長度、改進數據分析等。單分子測序技術，諸如基于納米孔(nanopore)的測序，可以解決這些挑戰中的一些；然而，這些方法具有其自身的一組技術難題，諸如可靠的納米結構制造、DNA易位速率的控制、明確的核苷酸鑒別、來自納米級傳感器的大陣列的信號的檢測和處理等，例如Branton等,Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。

已經提出核苷酸的光學檢測作為納米孔測序領域中的一些技術難題(例如難以從納米孔的大陣列收集獨立信號)的潛在解決方案。然而，對于基于熒光的信號，克服單分子光學檢測中的背景噪聲仍然是重大挑戰。這導致經常使用顯微鏡系統，諸如全內反射熒光(TIRF)系統，其使背景激發最小化但增加了檢測系統的復雜性和費用。

鑒于以上，如果可以獲得使用更簡單和更便宜的顯微鏡系統解決單分子分析的背景問題的方法和裝置，則對納米孔傳感器技術整體及其具體應用(諸如基于光學的納米孔測序)是有利的。

發明概述

本發明涉及使用光學標記物和納米孔進行單分子分析的方法和裝置。在一個方面，本發明的方法和裝置涉及降低在標記的聚合物分析物易位穿過納米孔時生成的光學信號中的噪聲。

在一些實施方案中，本發明涉及確定聚合物諸如多核苷酸的特征的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供包含固相膜和與其共同延伸的不透明層的納米孔陣列，所述納米孔陣列包括多個孔眼(apertures)并且分隔第一室和第二室，其中每個孔眼提供所述第一室和所述第二室之間的流體連通并具有信號生成區，且其中所述不透明層基本上防止光穿過所述納米孔陣列；(b)使聚合物從所述第一室穿過所述孔眼易位到所述第二室，每個聚合物具有附接到其上的一個或更多個光學標記物，所述光學標記物能夠生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波長的光學信號；(c)當所述聚合物易位穿過所述孔眼的所述信號生成區時，用具有第二波長的激發光束激發所述聚合物的光學標記物，其中檢測區中的所述光學標記物生成其第一波長不同于所述第二波長的光學信號；和(d)檢測來自所述信號生成區的所述光學標記物的光學信號，以確定所述聚合物的特征。

在一些實施方案中，本發明涉及確定聚合物的特征的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供包含固相膜的納米孔陣列，所述固相膜具有第一側、第二側和穿過其的多個孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每個孔眼提供所述第一室和所述第二室之間的流體連通，且其中所述固相膜的所述第一側具有在其上的不透明涂層，且每個孔眼具有從所述第一側的所述不透明涂層朝向所述第二側延伸的檢測區；(b)使聚合物從所述第一室穿過所述孔眼易位到所述第二室，每個聚合物具有附接到其上的一個或更多個光學標記物，所述光學標記物能夠生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波長的信號；(c)從所述固相膜的所述第二側用具有第二波長的激發光束照射所述孔眼的檢測區中的所述光學標記物，使得檢測區中的所述光學標記物生成其第一波長不同于所述第二波長的信號；(d)檢測來自所述檢測區中的所述光學標記物的信號以確定所述聚合物的特征。