[發明專利]檢測DNA單堿基突變的DNA探針和方法

有效

• 申請號: 201811211147.X
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109321650B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 楊斌;李葉;杜軍
• 申請（專利權）人: 湘潭大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6827
• 代理公司: 長沙新裕知識產權代理有限公司 43210
• 代理人: 周躍仁

本發明屬于分子檢測技術領域，提供了檢測DNA單堿基突變的DNA探針和方法，DNA探針序列如SEQ ID NO：1?9所示，將探針溶液稀釋后，煮沸退火冷卻至室溫，加入突變目標物恒溫反應，之后加入7Ff?3A和E?Q混合液，測定混合物的熒光光譜強度，進行因子分析，最終得到區分結果。本發明對環境樣本檢測準確、便捷，檢測方法特異性好，靈敏度高。

技術領域

本發明屬于分子檢測技術領域，具體涉及檢測DNA單堿基突變的DNA探針和方法。

背景技術

DNA單堿基突變包括單堿基取代、插入和缺失等，是人類疾病和藥物耐受的重要生物標志物。例如地中海貧血的分子基礎，就是11號染色體短臂上的基因序列發生單堿基突變，造成相關蛋白無法正常合成，誘發地中海貧血癥。

現有的單堿基錯配檢測方法，包括聚合酶鏈式擴增、二代測序、微陣列和原位雜交等。這些方法已經得到了商業化應用，但是它們需要昂貴的儀器、操作復雜且需要專業能力很強的操作人員，難以在普通實驗室和企業得到應用。同時，這些方法中需要設計特定結構的識別DNA探針，這需要專業人員長時間優化條件，才能得到想要的結果。因此，開發新型的單堿基突變檢測方法，將有利于得到更為廉價、通用、易于設計的新方法技術，推廣其在小型實驗室和企業的應用、降低其設計難度，拓寬方法的適用范圍。

發明內容

針對以上技術問題，本發明提供了檢測DNA單堿基突變的DNA探針和方法，解決了現有技術中存在的檢測方法設計復雜、儀器昂貴、專業操作繁瑣、操作人員專業性要求高等問題。

本發明所采用的技術方案為：檢測DNA單堿基突變的DNA探針，包括9個DNA探針，分別為MB-7C1，序列如SEQ ID NO：1、2所示，MB-7A1，序列如SEQ ID NO：3、4所示，MB-7T1，序列如SEQ ID NO：5、6所示，MB-7G1，序列如SEQ ID NO：7、8所示，MB-7DC，序列如SEQ ID NO：9、10所示，MB-7IT，序列如SEQ ID NO：11、12所示，MB-7IA，序列如SEQ ID NO：13、14所示，MB-7IG，序列如SEQ ID NO：15、16所示，MB-7IC，序列如SEQ ID NO：17、18所示。

本發明還公開了檢測DNA單堿基突變的方法，包括：

S1配置緩沖溶液、DNA探針溶液及7Ff-3A和E-Q混合液；7Ff-3A序列如SEQ ID NO：19所示，E-Q序列如SEQ ID NO：20所示；將權利要求1所述的DNA探針分別溶解制得所述DNA探針溶液；測定DNA探針溶液及7Ff-3A和E-Q混合液的濃度；

為了后續DNA探針溶液稀釋及混合反應時濃度準確，進行DNA探針溶液及7Ff-3A和E-Q混合液的濃度的測定。

S2為了后續步驟的測試，將步驟S1所述DNA探針溶液分別用緩沖溶液稀釋到0.1-10uM；為了使探針溶液充分雜交，在90-95度下煮沸退火1-10分鐘，冷卻至室溫；

S3識別不同DNA堿基突變：在步驟S2制得的DNA探針溶液中，分別加入突變目標物，恒溫反應；

S4步驟S3所得反應液中加入7Ff-3A和E-Q混合液反應；

S5結果分析：

(1)測定步驟S4所得混合物520nm處的熒光光譜強度；

(2)做出不同探針與突變目標物的對應表格，得到陣列式數據，采用SPSS9.0軟件中的因子分析功能，將陣列式數據導入到軟件中進行因子分析，將不同突變目標物的熒光探針響應數據的因子得分，進行對比，得到最終的區分結果：以95％的置信區間為判定依據，如果不同的樣品屬于一個置信橢圓內，則認定為同一突變類型。例如附圖2中，同一置信橢圓內的六個樣品則屬于同一錯配類型；一共有9個不同的置信橢圓，對應于9個不同的錯配類別。