[發明專利]人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲基因及應用

有效

• 申請號: 201710145166.6
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN106701792B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 郎志宏;李圣彥;張杰;梁革梅;汪海;黃大昉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明為“人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲基因及應用”，屬生物防治技術領域。本發明提供的對鱗翅目害蟲具有高毒力的mcry2Ah基因、mcry2Ah?vp基因和mcry2Ah?sp基因的人工優化、改造并合成的新的DNA序列(見SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，利用植物偏好的密碼子序列，可以提高mcry2Ah基因、mcry2Ah?vp基因和mcry2Ah?sp基因在轉基因植物中的表達量和穩定表達的特性，mcry2Ah?sp表現出對抗性鱗翅目害蟲的抗蟲性高于其他改造基因，可以利用該基因序列轉化植物防治害蟲和延緩害蟲抗性產生。

技術領域

本發明屬于生物防治技術領域，特別是涉及人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因基因序列及其應用。

背景技術

蟲害是世界農作物減產的一個重要因素，平均每年因此損失糧食總產量的10％左右，直接經濟損失達100億美元以上。過去幾十年的防治主要依賴化學農藥，在為農業生產做出巨大貢獻的同時，化學農藥卻造成了環境污染、人畜中毒、生態失衡等嚴重后果。在這些巨大的代價面前，全球都在尋找和開辟新的病蟲害防治策略和技術。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽胞的同時，能產生蛋白性質的伴胞晶體(parasporal crystal)，對鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology andMolecular Biology Review,62(3):775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)又稱δ-內毒素(Delta-endotoxin)，在昆蟲中腸首先溶解，成為原毒素，之后被腸道蛋白酶降解為具有專一活性的毒素，與中腸上特異的受體進行結合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，導致昆蟲死亡，蘇云金芽胞桿菌對人畜無害，不污染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了廣泛應用。

目前人們已經克隆了825種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬318種模式基因(可參見http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt//holo2.html)。

1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲晶體蛋白基因轉入煙草，開創了人類利用轉基因技術防治害蟲的先河(Vaeck et al,1987，Nature,328:33-37)。但是在轉基因研究中人們發現將來源于Bt的殺蟲蛋白基因直接轉入植物，存在著表達產物不穩定、表達量少的缺陷(van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524)。具體問題包括：1)天然Bt基因高含AT，超過60％，在植物體內這樣的基因表達的mRNA極易被植物降解；2)天然Bt基因中存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，從而造成轉錄不完整、mRNA異常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密碼子與植物存在較大差異，會造成蛋白翻譯效率降低；4)天然Bt基因作為原核生物來源的基因，其結構與植物等真核生物差異顯著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，這些關鍵問題的解決是實現Bt基因在植物中高效、穩定表達的重要保證。隨著這些技術的改進和完善，自1996年以來的二十年內，轉基因抗蟲玉米、馬鈴薯、水稻等作物相繼研制成功，并逐步進入應用階段(James C，ISAAABriefs，2016)。